Ce protocole montre comment utiliser les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et la technologie des organes sur puce pour générer une puce intestinale physiologiquement pertinente qui peut ensuite être utilisée pour prédire la pharmacocinétique et l’interaction médicamenteuse et pour étudier le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale. L’unification des organoïdes dans la technologie des organes sur puce nous permet de reproduire la complexité de l’épithélium intestinal. De plus, il permet un meilleur contrôle expérimental des signaux mécaniques, de la distribution des flux et des gradients biochimiques.
Cette méthode émule la physiologie complexe de l’intestin humain, ce qui permet de mieux comprendre les bases cellulaires et moléculaires des fonctions intestinales normales et pathologiques. Cela permet de mieux prédire la pharmacocinétique et la pharmacodynamie et les candidats médicaments potentiels pour prévenir les dommages inflammatoires. L’ensemencement est une étape critique du protocole.
Une fragmentation excessive ou une densité d’ensemencement inexacte des fragments organoïdes intestinaux peut compromettre le développement et la différenciation de la barrière épithéliale. Pour commencer, aspirez le milieu de la culture organoïde statique. Récupérer les milieux d’un nombre suffisant de puits pour atteindre une densité finale d’ensemencement de huit millions de cellules par millilitre.
Ajouter 500 microlitres de solution de dissociation BMM glacée à chaque puits et fixer le BMM solubilisé hors de la surface du puits. Rassemblez la suspension dans un tube de liaison à faible teneur en protéines de 15 millilitres et placez-la sur de la glace. Secouez doucement le tube toutes les 15 minutes pendant une heure.
Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir une pastille organoïde. Si une couche de gel transparent est observée au-dessus de la pastille, aspirer la solution du tube. Remettez la pastille en suspension et ajoutez un volume égal de solution de dissociation BMM.
Incuber sur glace pendant 10 minutes et centrifuger. Répéter jusqu’à ce qu’aucun résidu de BMM solubilisé ne soit présent. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans deux millilitres de solution de digestion organoïde.
Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant une à trois minutes et ajouter huit millilitres de DMEM F12 avancé pour arrêter la réaction enzymatique. Centrifuger et remettre en suspension la pastille dans un milieu de croissance organoïde complet pour atteindre huit millions de cellules par millilitre. Aliquote 360 microlitres dans des tubes de liaison stériles à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre.
Ensuite, retirez le milieu du canal supérieur des copeaux revêtus et ajoutez 30 microlitres de la suspension cellulaire. Incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour adhérer les fragments organoïdes à la membrane. Ajouter trois millilitres de milieu de croissance organoïde complet pré-équilibré au réservoir d’entrée supérieur et trois millilitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale pré-équilibré dans le réservoir d’entrée inférieur.
Ajoutez 300 microlitres du même média dans les réservoirs de sortie supérieurs et inférieurs respectifs. Transférez le plateau transportant les modules portables dans le module de culture. Sur le module de culture, exécutez à plusieurs reprises le cycle principal jusqu’à ce que suffisamment de gouttelettes se forment pour connecter avec succès les puces.
Faites ensuite glisser le support de puce dans le module portable. Ensuite, démarrez le cycle de régulation de deux heures pour pressuriser le milieu de culture dans le module portable et la puce, après quoi les conditions programmées reprendront. Ensuite, modifiez les paramètres d’étirement et démarrez le module de culture.
Après 24 heures, répétez le cycle avec 10% d’étirement et la même fréquence. Pour préparer le milieu de dosage ou le contrôle du véhicule, diluer les solutions mères inductrices du CYP ou le DMSO dans un milieu de croissance organoïde complet et un milieu de croissance des cellules endothéliales. Mettez le module de culture en pause et amenez les plateaux dans l’enceinte de biosécurité.
Remplacez le média dans tous les réservoirs d’entrée et de sortie par deux millilitres de média de dosage avec inducteurs ou commande du véhicule. Remettez les modules portables dans le module de culture et redémarrez le flux à 30 microlitres par heure. Remplacer le média par une solution inductrice fraîchement préparée toutes les 24 heures et poursuivre la culture pendant 48 à 72 heures.
Ensuite, amenez les plateaux à l’armoire de biosécurité et aspirez le milieu de dosage de tous les réservoirs. Lavez et remplacez le réservoir d’entrée supérieur par un milieu DMEM F12 avancé chaud et le réservoir inférieur par un milieu de croissance des cellules endothéliales. Remplacez le produit de lavage par un millilitre de solution de substrat de sonde.
Perfusez les copeaux à un débit élevé de 1 000 microlitres par heure pendant cinq minutes et aspirez les réservoirs de sortie supérieurs et inférieurs. Remettez les copeaux dans le module de culture et incuber pendant une heure sous un débit constant de 300 microlitres par heure. Après une heure de traitement, arrêtez l’écoulement et apportez les plateaux à l’armoire de biosécurité.
Recueillir 100 microlitres d’effluent du réservoir supérieur de sortie et l’ajouter à un tube contenant 200 microlitres de solution d’arrêt. Placez immédiatement les tubes sur de la glace sèche et conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Lavez les deux canaux avec 200 microlitres de DPBS stérile.
Bloquez ensuite la sortie du canal inférieur avec une pointe de pipette filtrante de 200 microlitres. Perfuser 50 microlitres de la solution de dissociation à travers le canal inférieur et incuber pendant deux minutes à température ambiante. Assurer le détachement complet des cellules endothéliales et retirer la solution de dissociation du canal par pipetage.
Répétez le lavage. Ensuite, bloquez la sortie du canal supérieur et perfusez 75 microlitres de tampon de lyse protéique. Laissez l’embout de la pipette inséré et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Recueillir les lysats cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre en pipetant cinq à 10 fois. Répéter la perfusion et la collecte pour obtenir le détachement complet des cellules et stocker les lysats à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Pour la lyse de l’ARN, suivez la même procédure tout en utilisant 150 microlitres de tampon de lyse de l’ARN.
Tout d’abord, préparez une solution de dosage d’interféron gamma en diluant les solutions mères dans un milieu de croissance de cellules endothéliales dégazées. Dans l’enceinte de biosécurité, retirez le fluide des réservoirs d’entrée du canal inférieur et remplacez-le par trois millilitres de solution doseuse par jour. Placez ensuite les plateaux dans le module de culture et perfuser les copeaux à un débit élevé de 1 000 microlitres par heure pendant cinq minutes.
Basculez le débit à 60 microlitres par heure et continuez la culture fluidique. Ajouter 100 microlitres de DPBS par puits dans une plaque à paroi noire de 96 puits. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 50 microlitres de l’effluent de tous les réservoirs aux puits respectifs.
Pour préparer une courbe standard, effectuer une triple dilution du milieu contenant 100 microgrammes par millilitre de trois kilodaltons de bleu de cascade de dextrane dans DPBS. Ensuite, effectuez des délires en série en utilisant une dilution triple du milieu de croissance des cellules endothéliales dans DPBS. Les caractéristiques morphologiques distinctes du duodénum et des puces du côlon ont été mises en évidence par la présence de formations en forme de villosités dans la puce du duodénum représentant l’architecture de l’intestin grêle.
Dans la puce du duodénum exposée aux inducteurs du cytochrome P450, la rifampicine et la vitamine D3, il y avait une expression élevée du gène de l’ARNm pour l’enzyme métabolisant le médicament cytochrome P450 3A4 et une activité catalytique accrue de l’enzyme cytochrome P450, indiquant des réponses d’induction appropriées chez les trois donneurs organoïdes. Lors du traitement de la monocouche épithéliale de la puce du côlon avec de l’interféron gamma, une morphologie cellulaire compromise et une perte de l’épithélium cylindrique ont été observées. En outre, le traitement par interféron gamma a entraîné une augmentation du signal cytoplasmique des protéines de jonction serrées et adhérentes par rapport au contrôle du véhicule, montrant le déplacement des marqueurs de jonction serrée ZO-1 et claudine 4 et l’internalisation de l’occludine et de la E-cadhérine.
Une augmentation significative de la perméabilité paracellulaire épithéliale a été observée après 48 heures de stimulation par l’interféron gamma sur des puces du côlon. De même, l’interféron gamma induit l’activation de l’apoptose indiquée par une augmentation du contenu intracellulaire de la Caspase 3 clivée. L’interféron gamma a induit une sécrétion polarisée de molécules pro-inflammatoires dans la puce du côlon, comme le montre la sécrétion basolatérale de VCAM-1 et d’interleukine-6 et la sécrétion apicale d’ICAM-1 et de la protéine amyloïde sérique A.Pour une culture réussie de puces intestinales, il faut utiliser des organoïdes indifférenciés et suivre les instructions de fragmentation et de densité d’ensemencement.
Après la mise en place réussie de la puce intestinale, nous pouvons étudier l’absorption, le transport et le métabolisme intestinaux, les niveaux de nutriments et la sécrétion d’hormones intestinales, les interactions entre les agents pathogènes du microbe hôte, l’innocuité et l’efficacité des médicaments, les mécanismes pathologiques spécifiques au patient et les réponses aux traitements.
