Les monocouches dérivées d’organoïdes récapitulent la fonction de barrière épithéliale intestinale du patient et permettent de tester l’effet de thérapies visant à améliorer le dysfonctionnement chez chaque patient pour identifier des stratégies de traitement personnalisées. Les monocouches organoïdes donnent accès au côté apical de l’épithélium, qui est le côté où les dommages se produisent, et c’est normal et accessible dans les organoïdes qui se développent sous forme de structures 3D. Chaque organoïde est différent, d’où la lutte.
Pour former des monocouches serrées, utilisez des organoïdes en phase de prolifération et digérez rapidement pour former des grappes de deux à quatre cellules. Titrez l’ensemencement cellulaire pour chaque modèle. La démonstration de la procédure sera effectuée par Wies Van Dooremalen, associé de recherche principal de HUB.
Commencez par recouvrir les inserts de membrane avec une matrice extracellulaire ou un ECM. En travaillant dans une armoire de biosécurité, placez les inserts de membrane dans la plaque de support. Diluer l’ECM 40X dans du DPBS glacé avec du calcium et du magnésium, puis pipeter 150 microlitres de l’ECM dilué dans le compartiment apical de chaque insert.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Pour préparer les cellules à l’ensemencement, préchauffer une aliquote de réactif de dissociation cellulaire dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Utilisez deux millilitres de réactif pour chaque puits d’une plaque de six puits.
Transférer la plaque de culture contenant les organoïdes de l’incubateur à l’armoire de biosécurité. Traitez les organoïdes comme décrit dans le manuscrit du texte, mais ne regroupez pas plusieurs tubes en un seul tube. Après le prélèvement des organoïdes, ajouter le milieu basal ou BM à 12 millilitres et centrifuger à 85 fois G, puis aspirer le surnageant.
Remplissez le tube contenant les organoïdes avec jusqu’à 12 millilitres de DPBS, puis pipetez de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Centrifuger à 85 fois G pendant cinq minutes à huit degrés Celsius et aspirer le surnageant sans perturber la pastille organoïde. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire préchauffé aux organoïdes et les remettre en suspension, puis incuber les tubes en diagonale ou horizontalement pendant cinq minutes au bain-marie à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation, pipettez de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette en plastique stérile de cinq millilitres ou d’une pipette P1000. Vérifiez la suspension organoïde au microscope pour voir si un mélange de cellules individuelles et de quelques amas cellulaires constitués de deux à quatre cellules s’est formé. Arrêtez la dissociation cellulaire en ajoutant jusqu’à 12 millilitres de BM avec inhibiteur de ROCK à la suspension cellulaire.
Centrifugez les cellules, puis aspirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Lorsque vous manipulez la même culture organoïde dans plusieurs tubes, regroupez les pastilles cellulaires avant de les réutiliser dans 12 millilitres de BM. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres pré-mouillée avec BM et récolter l’écoulement dans un tube conique de 50 millilitres, puis laver la passoire avec 10 millilitres de BM et récolter le flux dans le même tube. Transférer la suspension de cellules tendues dans deux nouveaux tubes coniques de 15 millilitres et répéter la centrifugation.
Aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans quatre millilitres d’IEM complétés par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK par plaque de culture complète utilisée comme matériau de départ. Mélangez une petite quantité de suspension cellulaire dans un rapport de un pour un avec Trypan Blue pour compter, puis comptez les cellules et calculez le nombre total de cellules vivantes, en comptant chaque cellule individuelle en petites touffes. Préparer une suspension cellulaire contenant 3X 10 à la sixième cellule vivante par millilitre d’IEM complétée par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK.
Pour ensemencer les cellules, aspirez soigneusement le DPBS à partir des inserts revêtus d’ECM, en gardant la plaque horizontale. Pipette 800 microlitres d’IEM complétés par inhibiteur de ROCK dans chaque compartiment basolatéral et 150 microlitres de la suspension cellulaire préparés sur la membrane revêtue d’ECM dans le compartiment apical goutte à goutte. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Une fois que les cellules ont sédimenté sur la membrane, mesurez chaque jour la résistance électrique transépithéliale ou TEER et imagez les inserts membranaires à l’aide d’un microscope. Pour rafraîchir les monocouches, retirez le milieu des compartiments basolatéraux de la plaque contenant les inserts membranaires, puis aspirez soigneusement le milieu des compartiments apicals. Ajouter 150 microlitres d’IEM frais goutte à goutte à chaque compartiment apical et ajouter 800 microlitres d’IEM frais à chaque compartiment basolatéral.
Si vous utilisez un compteur TEER manuel, nettoyez l’électrode avec de l’éthanol à 70% et laissez-la sécher à l’air libre à l’intérieur de l’armoire de biosécurité, puis placez l’électrode dans un tube contenant du BM. Connectez l’électrode au compteur TEER manuel et allumez l’interrupteur de fonction pour mesurer en ohms et l’interrupteur d’alimentation. Placez l’électrode courte dans le compartiment apical de l’insert et l’électrode longue dans le compartiment basolatéral sans toucher la monocouche. Mesurer la résistance dans le puits à blanc, puis dans les échantillons restants.
Lavez l’électrode avec BM entre des échantillons de conditions différentes. Une fois terminé, nettoyez l’électrode avec de l’eau et avec de l’éthanol à 70%, puis laissez-la sécher à l’air. Ce protocole a été utilisé pour prélever des organoïdes intestinaux et préparer des monocouches de cellules épithéliales.
Une monocouche qui a été cultivée pendant huit jours dans IEM est montrée ici. Une structure peut être observée lors de l’exposition de monocouches à un milieu de différenciation des entérocytes ou à une GED, tandis que les monocouches exposées à un milieu combiné ou à un MDP présentent une structure plus lisse. La formation de monocouches a été quantitativement suivie de la mesure de TEER.
Une monocouche complètement confluente avait une valeur TEER d’environ 100 ohms centimètres carrés qui augmentait lorsqu’elle était exposée à l’un ou l’autre milieu de différenciation. Les monocouches dans toutes les conditions moyennes ont montré une perméabilité apparente plus faible au jaune de Lucifer. La sécrétion de lysozyme par les monocouches iléales cultivées en IEM était supérieure à celle des monocouches cultivées en IEM jusqu’à confluent et pendant quatre autres jours en EDM ou CDM.
Les monocouches cultivées dans l’IEM, l’IEM et l’EDM ultérieure, ou l’IEM et le CDM ultérieur montrent des différences de morphologie qui ont été observées avec les colorations H&E, Ki67, MUC2 et Alcian Blue. Lors de la différenciation, les cellules prolifératives ont diminué, tandis que l’expression des gènes marqueurs gobelet et entérocytes a augmenté par rapport à celle observée dans les conditions IEM, comme le montrent LGR5, MUC2 et l’expression des gènes de la phosphatase alcaline. Lors de la préparation de monocouches, il est important de prévenir les anoikis dans les organoïdes après les avoir digérés.
De plus, l’ECM dans les cellules doit être réparti uniformément sur les membranes Transwell. Les monocouches dérivées d’organoïdes permettent d’évaluer les transports de molécules à l’aide de différents substrats fluorescents d’une manière spécifique au patient.
