Pour commencer, préparez la solution de sélénoprotéine à l’aide d’un test de décalage thermique ou d’un tampon TSA. distribuer les protéines, les petites molécules et le colorant SYPRO Orange dans les puits appropriés d’une plaque de 384 puits. Couvrez la plaque d’un film adhésif optiquement transparent et abaissez brièvement la plaque à 1 000 g pendant une minute dans une centrifugeuse.
Ensuite, placez la plaque dans une machine PCR en temps réel et programmez-la pour maintenir l’échantillon à 20 degrés Celsius pendant deux minutes, suivi d’une augmentation de 0,5 degré de la température par minute jusqu’à 95 degrés Celsius. Exportez les données de la machine RT PCR pour les unités de fluorescence relatives, ou RFU, par rapport à la température. À l’aide du logiciel de votre choix, extrayez et tracez des points de données jusqu’à l’intensité la plus élevée mesurée pour chaque courbe de fusion.
Déterminez la température de fusion avec l’ajustement sigmoïdal de Boltzmann pour les données permettant de déterminer la température de fusion ou Tm.Les courbes de dénaturation thermique ont indiqué une augmentation de quatre degrés Celsius de la stabilité thermique d’Escherichia coli SelO en présence d’ATP avec des ions magnésium et une augmentation de 12 degrés Celsius de la même pour l’ATP avec des ions manganèse. Cependant, il n’y a pas eu de changement de stabilité thermique lors de l’incubation avec l’UTP, ce qui indique qu’Escherichia coli SelO peut ne pas présenter de liaison détectable à l’UTP. Les témoins sans protéines et sans colorant avaient un signal de fluorescence faible, qui ne répondait pas à l’augmentation de la température.
