Cette méthode peut aider à étudier les directions des protéines avec les membranes lipidiques. Dans notre cas, utilisez-le pour analyser la liaison dépendante du calcium des annexes aux phospholipides chargés négativement. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est sans étiquette, sensible, quantitative, et que les interactions peuvent être observées en temps réel.
Permettant ainsi une analyse directe des résultats réels. Cette technique peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que l’interaction d’assemblages de micromolécules plus complexes ou même de cellules. Utilisez des solutions lipidiques claires de cinq millimolaires telles que décrites dans le protocole textuel.
Mélanger les lipides dissous dans le rapport molaire désiré dans des tubes en verre de 10 millilitres. Évaporer les solvants organiques à l’aide d’un flux sec d’azote. Laissez le mélange lipidique sur un système de lyophilisation à vide élevé pendant trois heures pour éliminer les traces résiduelles des solvants.
Maintenant, resuspendez le film lipidique dans un millilitre de tampon de citrate. Incuber la suspension lipidique à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un bain d’eau, en la vortexant vigoureusement toutes les cinq minutes. Cette température est d’environ 10 degrés Celsius au-dessus de la température de transition de phase du lipide de fusion le plus élevé dans le mélange.
Pendant ce temps, préchauffer l’extrème équipé d’une membrane en polycarbonate de 50 nanomètres de diamètre de diamètre au-dessus de la température de transition pendant 30 minutes. Chargez la suspension vésicule multilamellar dans l’extrextruge préchauffé. Passez doucement le mélange 31 fois à travers la membrane en polycarbonate pour former de petites vésicules ou VUS unilamellar.
Maintenez la température au-dessus de la température de transition. Transférez la suspension du VUS sur un récipient de réaction en plastique de deux millilitres et ajoutez le tampon de citrate pour porter le volume final à deux millilitres. Incuber quatre capteurs insérés dans un support en polytétrafluoroéthylène dans une solution SDS à 2 % pendant au moins 30 minutes.
Ensuite, lavez-les abondamment avec de l’eau ultra pure pour enlever complètement le SDS et essayez-les à l’aide d’un jet d’argon sec ou d’azote. Utilisez un système de nettoyage plasmatique pour éliminer complètement les contaminants. Pour ce faire, insérez les capteurs secs dans la chambre de nettoyage du plasma, évacuez la chambre et rincez-la trois fois avec de l’oxygène.
Ensuite, allumez le nettoyeur de plasma. Utilisez le vide, la haute fréquence radio et 10 minutes de temps de traitement. Après la course de nettoyage, éteignez la machine et sortez les capteurs.
Amarrer soigneusement les capteurs nettoyés au plasma dans les quatre chambres d’écoulement à l’aide d’une pince à épiler. Évitez toute pression ou torsion des chambres et des tubes qui peuvent causer des fuites. Rincer le système avec un tampon de citrate en mode flux ouvert pendant 10 minutes.
Lancez le programme. Commencez à enregistrer tout changement dans la fréquence et la dissipation de la première tonalité fondamentale et les nuances à l’aide du logiciel jusqu’à ce que la fréquence et les lignes de base de dissipation soient stables. Lorsque les lignes de base sont stables, appliquez la suspension suv dans le tampon de citrate.
À l’aide d’un récipient de réaction, retirez 1,5 millilitres du volume mort, puis fermez le système en mode flux de boucle. Enregistrez le décalage de dissipation de fréquence pendant encore 10 minutes. Lorsque le SLB est stable, équilibrer le système avec un tampon en cours d’exécution aux concentrations de calcium requises en mode flux ouvert pendant 40 minutes.
Ajouter la protéine au tampon en cours d’exécution contenant du calcium. Effectuez l’application de la protéine en mode flux de boucle jusqu’à ce qu’un état stable d’équilibre soit atteint. Maintenant, dissociez la protéine liée en chélating ions de calcium avec EGTA de cinq millimolaires dans le tampon fonctionnant en mode d’écoulement ouvert.
Régénérer le système de microbalance avec 50 millilitres d’eau distillée double en mode continu d’écoulement ouvert. Retirez les tubes du récipient d’eau et laissez le système sécher. Retirez soigneusement le capteur de cristal et nettoyez-le avec une solution SDS à 2 % à l’aide du support en polytétrafluoroéthylène.
Séchez les parties visibles de l’intérieur du module d’écoulement où le capteur a été placé. Montré ici, est l’enregistrement de la courbe de fréquence et les changements de dissipation. La baisse importante de la fréquence lors de l’ajout des liposomes, indique leur absorption parce que les vésicules remplies tampon ne sont pas rigides mais viscoélastiques, la dissipation augmente.
Par la suite, les vésicules de la moisse se rompent. La libération concomitante du tampon à l’intérieur des vésicules diminue la masse adsorbée jusqu’à ce qu’un plateau stable soit atteint. La liaison de l’Annexe A2 aux lipides ajoute de la masse telle qu’elle est perçue par le changement de fréquence clair, mais n’interfère pas avec la structure de la caleuse, comme l’indique le seul petit changement de dissipation.
Lorsque l’ion calcique est retiré par l’agent chélateur, EGTA, Annexin A2 se dissocie du film lipidique. La fréquence et les enregistrements de dissipation se déplacent vers les niveaux observés avec la bicouche indiquant seulement que la liaison Annexin A2 dépend totalement de l’ion calcium et que le film lipidique reste intact. Une expérience représentative de contrôle négatif est présentée ici.
Lorsque la phosphatidylsérine est absente, aucun changement de fréquence ou de dissipation n’est apparent après l’ajout de l’Annexe A2 en présence de l’ion calcium. Tout en essayant cette procédure, il est important d’assurer la formation appropriée de cale. Utilisez immédiatement les liposomes, sinon les petites vésicules fusionneront en plus grandes avec moins de tension de surface qui peuvent conduire à une ligne de base instable.
Après cette procédure, une description quantative d’une interaction de protéine de membrane peut être exécutée afin de répondre aux questions additionnelles comme la liaison coopérative contre non coopérative.
