Pour commencer, obtenez des cellules HEK 293T et une plaque de 800 000 cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits dans un milieu DMEM supplémenté. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pour obtenir une confluence de 60 à 80 %. Ensuite, mélangez un microgramme de chaque ADN plasmidique avec 200 microlitres de DMEM sans sérum et six microlitres de réactif de transfection.
Après 15 minutes d’incubation, distribuer 100 microlitres de mélange de transfection par puits de cellules. Incuber toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le troisième jour, ajoutez une quantité appropriée de rapamycine ou d’éthanol séparément aux cellules et incubez-les pendant une heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Placez ensuite la plaque sur de la glace et lavez délicatement les cellules avec trois millilitres de PBS froid. Après avoir retiré le PBS, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse contenant soit de la rapamycine, soit de l’éthanol, et grattez les cellules avec un grattoir cellulaire. Transférez l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre et microcentrifugez-le pendant 10 minutes à 1 000 g à quatre degrés Celsius.
Pour vérifier les niveaux d’expression, aliquote 20 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Incuber l’échantillon avec 20 microlitres de 2 tampons Laemmli contenant 5 % de mercaptoéthanol bêta à 95 à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.
