Pour commencer, obtenez les cellules HEK293T exprimant RapR-Shp2 et effectuez une immunoprécipitation avec la protéine G-Sepharose. Après l’immunoprécipitation, laver le sépharose deux fois chacune avec 0,5 millilitre de tampon de lyse, suivi de 0,5 millilitre de tampon de lavage. Retirez autant de tampon que possible après le dernier tour.
Ajoutez ensuite 40 microlitres de phospho-paxilline dans un mélange de tampon imidazole à chaque échantillon avec ou sans une rapamycine micromolaire. Agitez doucement le tube et placez-le immédiatement dans l’agitateur chauffant pendant 40 minutes à 32 degrés Celsius. Réglez l’agitateur de chauffage à 1000 tours par minute pour assurer une agitation complète de l’échantillon.
Pour arrêter la réaction, ajoutez 40 microlitres de tampon 2X Laemmli à chaque échantillon et incubez-les à 95 à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois les échantillons refroidis, chargez 15 microlitres de chaque échantillon sur un gel de polyacrylamide SDS de 4 à 15 % de gradient. Exécutez un protocole de transfert Western standard à l’aide de membranes PVDF.
Enfin, épongez à l’aide d’un anticorps anti-FLAG pour détecter la construction RapR-Shp2 et d’un anticorps anti-phospho-paxilline pour détecter la paxilline phosphorylée dans les échantillons. RapR-Shp2 actif n’a montré aucune phospho-paxilline, similaire à Shp2 constitutivement actif, indiquant une activité complète conservée. RapR-Shp2 inactif et Shp2 négatif dominant ont montré des niveaux de phospho-paxilline similaires, indiquant qu’il n’y avait aucune activité lorsqu’ils étaient inactifs.
