Pour commencer la préparation de l’échantillon pour la cytométrie en flux, sortez de l’incubateur des tubes de stimulation contenant des échantillons de sang entier contenant de la Brefeldine A. Ajoutez 500 microlitres de solution EDTA 0,5 molaire dans chaque tube de stimulation contenant de la Brefeldine A. Transférez les échantillons dans de nouveaux tubes à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, pipetez un millilitre de tampon de lyse érythrocytaire dans chaque tube de stimulation pour le rincer.
Transférez le tampon et la suspension cellulaire dans le même tube de centrifugation. Centrifugez les tubes à 600 g pendant sept minutes et pipetez soigneusement le surnageant. Ajoutez ensuite un tampon de lyse érythrocytaire à la pastille et remettez-la en suspension.
Incuber les échantillons à température ambiante jusqu’à ce qu’ils apparaissent clairs ou pendant un maximum de six minutes. Centrifugez les tubes à 600 g pendant sept minutes. Après avoir jeté le surnageant, ajoutez un millilitre de HBSS à la pastille.
Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de réaction de deux millilitres. Ensuite, centrifugez les tubes à 400 g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant avant d’effectuer la coloration par cytométrie en flux.
Transférez les échantillons des tubes de stimulation qui ne contiennent pas de Brefeldin A dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes à 2 000 g pendant 20 minutes. Maintenant, pipetez soigneusement le surnageant dans un tube frais de 1,5 millilitre.
Si vous n’analysez pas immédiatement le surnageant, cryoconservez l’échantillon à 80 degrés Celsius. Lors de l’utilisation d’échantillons congelés, la centrifugeuse a de nouveau décongelé les surnageants à une vitesse supérieure à 7 000 g pendant cinq minutes avant l’analyse. Effectuer la pré-dilution des échantillons comme l’exige le protocole de dosage des cytokines.
Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de protection ARN. Cryoconservez-le à 80 degrés Celsius pour l’isolement ultérieur de l’ARN. Alternativement, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 700 microlitres de tampon de lyse pour une isolation immédiate de l’ARN.
