Pour commencer, décongelez des cellules épithéliales de surface ovarienne humaines cryoconservées. Mélangez les cellules avec 10 millilitres de produit de lavage. Après avoir centrifugé les cellules, remettez la pastille en suspension dans deux millilitres d’épithélium de surface ovarienne ou de milieu OSE 2D et transférez-la dans deux puits d’une plaque à 12 puits.
Ajoutez un millilitre de milieu OSE 2D supplémentaire dans le puits et cultivez à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures avant le premier renouvellement du milieu. Utilisez la coloration au bleu trypan pour compter les cellules épithéliales épithéliales de surface ovarienne humaines vivantes fraîchement isolées ou cryoconservées et décongelées avec un compteur de cellules automatisé. Mélangez le nombre désiré de cellules dans un millilitre de milieu organoïde basique OSE glacé et centrifugez le tube à 240 G pendant cinq minutes.
À l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution d’extrait de membrane basale non diluée glacée pour obtenir 10 000 cellules par 10 microlitres. Ajoutez 10 gouttelettes d’un microlitre de solution d’extraction de membrane basale OSE par puits dans une lame préchauffée à plusieurs chambres et placez la plaque à l’envers à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 minutes. Une fois le gel solidifié, ajoutez 100 microlitres de milieu OSE 3D et cultivez à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.
Après avoir retiré le milieu épuisé, ajoutez 100 microlitres de DMEM F12 avancé glacé dans chaque puits. Raclez le fond des puits avec une pointe de pipette P1000 pour détacher les gouttelettes de gel et transférez chaque gouttelette de gel flottante dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 240 G pendant cinq minutes.
Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 300 microlitres de tampon de dissociation cellulaire et placez les tubes dans un bain de billes préchauffé à 37 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de milieu organoïde de base OSE humain et centrifugez à 240 G pendant cinq minutes. Enfin, remettez en suspension la pastille dans le volume souhaité de solution d’extrait de membrane basale non diluée pour les réensemencer à un rapport approprié pour la culture.
Les cellules osseuses humaines primaires ont présenté une morphologie semblable à celle d’un pavé jusqu’au troisième passage, mais ont montré des signes de sénescence par la suite. Les organoïdes OSE humains provenant de cellules OSE fraîchement isolées sont devenus plus grands que ceux provenant de cellules OSE expansées en 2D après 14 jours de culture. Diverses morphologies ont été observées dans les organoïdes OSE 3D, y compris les amas de cellules kystiques, monocouches, multicouches et non luménisés.
