Notre modèle organoïde est très précieux pour explorer la biologie des cellules souches hypophysaires dans les conditions de remodelage homéostatique et hypophysaire, telles que la maturation néonatale de la glande, le déclin fonctionnel associé au vieillissement et la croissance tumorale dans la glande. À ce jour, notre technique organoïde hypophysaire est le seul outil disponible pour développer et développer de manière fiable et robuste les cellules souches hypophysaires primaires de souris. Emma Laporte et Charlotte Nys, doctorantes de mon groupe de recherche, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, lavez la tête de la souris avec de l’eau désionisée pour enlever le sang. Vaporisez 70% d’éthanol sur la tête pour générer un environnement stérile. Ensuite, retirez la peau entre les oreilles à l’aide d’outils chirurgicaux stériles.
Pour ouvrir le crâne, cassez le pont du nez avec des ciseaux stériles. Ouvrez davantage le crâne en partant du pont du nez vers les oreilles des deux côtés. Retirez le crâne et le cerveau avec une pince à épiler stérile sans toucher l’hypophyse.
Retirez les diaphragmes à l’aide d’une pince à épiler émoussée. Ensuite, sous un stéréomicroscope, séparez le lobe antérieur des lobes postérieur et intermédiaire. Isolez soigneusement le lobe antérieur avec une pince à épiler émoussée et rassemblez-le dans une fiole d’Erlenmeyer de 10 millilitres contenant trois millilitres de milieu A.Ajouter deux millilitres de solution de trypsine préchauffée à 2,5%.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajouter deux millilitres de solution de DNAse préchauffée et faire tourbillonner la fiole d’Erlenmeyer 10 fois. Laissez l’hypophyse couler au fond et retirez le surnageant.
Ajouter deux millilitres de solution d’inhibiteur de la trypsine préchauffée et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le surnageant lorsque l’hypophyse s’enfonce au fond. Ajouter deux millilitres de milieu B préchauffé et incuber pendant cinq minutes.
Ajoutez deux millilitres de milieu C préchauffé et incubez pendant 15 minutes. Laissez l’hypophyse couler au fond et retirez le surnageant. Ensuite, rincez-le trois fois avec un milieu préchauffé C.Ajoutez deux millilitres de milieu préchauffé C.Aspirez et expulsez l’hypophyse avec une pipette Pasteur stérile et polie à la flamme plusieurs fois jusqu’à ce que les fragments ne soient plus visibles.
Transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres contenant 4,5 millilitres de solution de DNAse préchauffée. Rincez la fiole trois fois avec deux millilitres de milieu C préchauffé et transférez la suspension dans le tube. Mélangez la suspension cellulaire collectée et filtrez-la à travers une passoire cellulaire de 40 microns dans un tube de 30 millilitres.
Rincez le tube et la passoire à cellules trois fois avec deux millilitres de milieu C et transférez la suspension dans le tube. Remplissez une pipette Pasteur en verre avec deux millilitres de BSA. Placez l’extrémité de la pipette au bas du tube et pipettez doucement pour former une couche de densité visible.
Centrifuger à 190 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de DMEM/F-12 avancé glacé. Ensuite, quantifiez les cellules avec un compteur de cellules.
Centrifugez la suspension cellulaire à 190 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant. Remettez en suspension la pastille de cellule dans le DMEM/F-12 avancé pour atteindre une densité cellulaire de 1,1 fois 10 à 6e cellules par millilitre. Ajouter l’ECM au volume souhaité de suspension cellulaire dans un rapport de 30:70 et bien mélanger.
Déposez une goutte de 30 microlitres de ce mélange dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 48 puits. Tournez la plaque à l’envers et laissez l’ECM se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, ajouter soigneusement 250 microlitres de milieu organoïde hypophysaire préchauffé complété par un inhibiteur de ROCK 10 micromolaires.
Tous les deux à trois jours, changez le milieu sans inhibiteur de ROCK pendant 10 à 14 jours jusqu’à ce que les organoïdes soient complètement développés. Pour passer les organoïdes, aspirez d’abord doucement le milieu et ajoutez 400 microlitres de DMEM/F-12 avancé glacé pour désintégrer l’ECM. Ensuite, collectez les organoïdes dans un tube de microcentrifugation.
Lavez le puits avec 400 microlitres de DMEM/F-12 avancé glacé. Centrifuger le tube à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et ajoutez 400 microlitres d’enzyme TrypLE Express préchauffée.
Mélanger en inversant le tube plusieurs fois et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter 400 microlitres de DMEM/F-12 avancé glacé. Centrifuger à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant.
Remettez en suspension la pastille avec 100 microlitres de DMEM/F-12 avancé glacé. Rétrécissez une pointe P-200 et utilisez la pointe pour dissocier les organoïdes en pipetant vigoureusement jusqu’à ce que des fragments organoïdes soient obtenus. Ajoutez 800 microlitres de DMEM/F-12 avancé.
Centrifuger à 190 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant. Pour passer les organoïdes, remettez en suspension la pastille dans un volume adéquat de DMEM/F-12 avancé et ajoutez de l’ECM dans un rapport de 30:70. Bien mélanger.
Continuez à semer et à cultiver les organoïdes comme décrit dans le manuscrit du texte. Des cellules individuelles dissociées du lobe antérieur ont été ensemencées dans l’ECM et cultivées dans un milieu organoïde hypophysaire. 14 jours après l’ensemencement, les organoïdes étaient complètement développés et atteignaient un diamètre allant jusqu’à 500 micromètres.
À ce stade, les organoïdes présentaient une morphologie kystique avec une couche épithéliale enfermant une lumière. Il n’est pas recommandé d’utiliser les puits dans lesquels des structures denses apparaissent après la croissance. Pour le passage, des fragments organoïdes ont été utilisés pour l’ensemencement.
Sept jours après le passage, une repousse organoïde favorable a été observée avec des structures kystiques. Les organoïdes denses doivent être jetés, car les organoïdes défavorables peuvent prendre le contrôle de la culture. L’analyse de coloration par immunofluorescence des marqueurs épithéliaux E-cadhérine et cytokératines 8 et 18 a confirmé le caractère épithélial des organoïdes.
L’expression des marqueurs de cellules souches hypophysaires Sox2 et Trop2 a démontré la souche, et le marqueur spécifique de l’hypophyse LHX3 a montré le phénotype hypophysaire des organoïdes. L’expression du marqueur Ki67 a montré que les cellules organoïdes constitutives sont dans un état prolifératif. L’analyse PCR RTQ a montré une expression plus élevée des marqueurs de tige dans les organoïdes que dans le lobe antérieur, même après plusieurs passages, validant l’enrichissement des cellules souches.
Il est important de plaquer le nombre approprié de cellules individuelles dans le dôme ECM lors de l’ensemencement initial, et lors du passage des organoïdes, il faut se rappeler de réensemencer des fragments et non des cellules individuelles.
