Nous remercions Jesper Kronhamn et Dan Hultmark, Michael Galko, et l&#39;Bloomington Stock Center pour les stocks de mouches. Un merci spécial à Courtney Onodera pour obtenir des conseils analyse statistique. Nous remercions Katrina d&#39;or pour la lecture critique du manuscrit, et Kalpana Makhijani, Katrina Or, les membres du laboratoire Derynck, et les membres du laboratoire Nystul pour examen et commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme de l&#39;UCSF pour la recherche biomédicale Breakthrough (PBBR), Broad Center, Fondation Hellman, American Cancer Society RSG DDC-122595, l&#39;American Heart Association 13BGIA13730001, la National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health et 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (à KB).

1. hémocytaire purge / Scrape Assay <ol><li> Préparation des lames: <ol><li> Option 1 pour les microscopes à balayage sans fonction de tuiles: Pour chaque larve à analyser, préparer une lame de verre avec environ cinq puits Pap-stylo carrés de 2 mm chacune, correspondant à la zone d&#39;affichage de champ du microscope; ajouter environ 5 - 10 pi de milieu S2 à chaque (figure 1A). Gardez les diapositives dans la chambre humide pour éviter puits de se dessécher. </li><li> Option 2 pour microscopes avec fonction de balayage de tuile: Pour chaque larve à analyser, préparer une diapositive en verre avec 3 à 4 puits Pap-stylo de ~ 3 - 4 mm carrés chacun; ajouter environ 15 - 20 pi de S2 médias à chaque puits (figure 1B). Gardez les diapositives dans la chambre humide pour éviter puits de se dessécher. REMARQUE: Le nombre de puits recommandé ci-dessus est suffisante pour les totaux de jusqu&#39;à 3.000 hémocytes par larve (stade larvaire 2 ème tard, ~ 2,5 à 3 mm de longueur, transgène étiquetage de la majorité des larval Les cellules sanguines). Lors de l&#39;évaluation du nombre de cellules de sang de plus grandes, plus les puits pourraient être nécessaires pour éviter la surpopulation. </li></ol></li><li> Collection de larves: <ol><li> Gicler l&#39;eau dans un flacon contenant des larves de mouche et les larves de chasse dans une boîte de Pétri, ou ramasser un peu de nourriture qui contient larves dans une boîte de Pétri et diluer avec de l&#39;eau à l&#39;aide d&#39;un vaporisateur. </li><li> Doucement ramasser les larves de la boîte de Pétri aide d&#39;un pinceau et les placer dans l&#39;eau dans un plat creux ou sur une lame sur un bloc froid. REMARQUE: Les larves peut être maintenue pour une durée limitée dans l&#39;eau ou sur un bloc froid; utiliser des spécimens dans les 45 minutes ou moins pour éviter la mort des larves ou des effets indésirables sur les hémocytes. </li></ol></li><li> Dissection: <ol><li> Sélectionner larves sous un microscope à fluorescence sur un bloc de métal froid. Mesurer la taille et des larves d&#39;image, si désiré. </li><li> Isolement des hémocytes circulant (&quot;Purger&quot;): <ol><li> Une fois que les larves sont sélectionnés, placer une larve dans la première Pap-plume bien (figure 1C,2A). </li><li> Utilisez 2 aiguilles propres ou des ciseaux et des pinces à dissection de faire une incision à la fois aux extrémités antérieures et postérieures de la larve. Pour éviter de déranger hémocytes résidents, il est préférable de faire ces incisions sur la face ventrale de la larve. Pour des résultats cohérents, faire les incisions dans les mêmes endroits pour chaque larve. Pour le 1er stade larvaire, une incision (dans la partie antérieure ventrale) est suffisante. </li><li> Laisser larve à saigner pendant quelques secondes, sans aucune pression ou agitation physique (figure 2A). NOTE: Si vous travaillez sur plusieurs larves, il est préférable de faire ces incisions pour chacun d&#39;eux avant de passer à l&#39;étape suivante pour éviter de garder les larves sur la glace trop longtemps ce qui pourrait affecter l&#39;intégrité des échantillons. </li><li> Soulevez doucement la larve avec les aiguilles ou des pinces et le tremper dans le deuxième puits de rincer toute hémocytes circulant restants. Après cela, suivez avec la sortie de hémocytes résidents. </li></ol></li><li&gt; Isolement de hémocytes résidents (&quot;Scrape&quot;): <ol><li> Transférer doucement la larve à l&#39;autre bien (figure 2C). </li><li> Identifier le ganglion lymphatique de la chenille, qui est généralement situé à environ 1/3 de l&#39;extrémité antérieure de la chenille, et qui peut émettre une fluorescence à travers la paroi dorsale du corps larvaire. Évitez la glande lymphatique tout en libérant hémocytes résidents par épingler la larve avec une aiguille aussi près que possible de la glande lymphatique pour éviter la perforation (figure 2C). REMARQUE: Pendant le développement normal de la maturation des lymphatiques hémocytes de la glande est retardée par rapport à hémocytes larvaires, et les journalistes fluorescentes de hémocytes différenciés ne peut pas montrer un signal dans le ganglion lymphatique de jeunes larves. Dans ces cas, moins d&#39;attention doit être accordée à la glande lymphatique que l&#39;absence de contamination des différenciées hémocytes larvaires marqués par fluorescence par hémocytes des ganglions lymphatiques est attendu. </li><li> Relâchez globules résidents dans un dissectisur le processus de grattage et / ou piquant. Utilisez une aiguille à cerner efficacement contre la larve près du ganglion lymphatique (voir ci-dessus) ou d&#39;autres zones du corps comme nécessaire. Utilisez une autre aiguille pour piquer les grappes de hémocytes qui sont visibles à travers la paroi du corps des larves (figure 2C, E), visant à séparer les hémocytes. Hémocytes peut également être libéré dans un mouvement de raclage. Cependant, la déchirure de l&#39;épiderme précoce peut libérer de grandes grappes de cellules sanguines, ce qui pourrait rendre plus difficile le comptage automatique. NOTE: Selon l&#39;âge et le génotype de la larve, le nombre de hémocytes total variera. Distribuer le processus de libération décrit ci-dessus sur plusieurs puits pour éviter la surpopulation de certains puits avec des cellules de sang, ce qui pourrait faire seule analyse d&#39;image de cellule plus difficile. </li><li> Si quelques hémocytes restent dans la carcasse finale, compter ces hémocytes par l&#39;observation au microscope et l&#39;utilisation d&#39;un manuel Tally Counter (figure 2E). Pour faciliter le comptage, placer la carcasse sur une surface propre de la même lame et l&#39;étaler aussi finement que possible pour réduire le nombre de plans optiques. </li><li> Une fois la dissection est complète, attendre entre 5 - 10 min pour les cellules sédimenter (mais pas nécessairement adhérer) avant l&#39;imagerie des puits. Incuber la lame dans une chambre humide pour éviter le séchage, et d&#39;éviter une manipulation brutale des diapositives, qui pourraient perturber les hémocytes installés. REMARQUE: Lors de la détermination chiffres hémocytaires, cellules libérées sont pas fixes et les cellules doivent être imagés peu de temps après la dissection, de préférence dans les 30 minutes après la sortie de la larve. Selon le volume de biens de moyennes et de la cellule, la grande majorité des cellules aura réglé dans les 5 - 10 min, ce qui devrait être confirmé en mettant l&#39;accent à travers les plans optiques du milieu dans le puits. Cependant, seule une fraction de globules aura adhéré à la surface de glissement de ce temps, ce qui doit être pris en compte si la modification de ce protocole de base de fixation approache cellulaires. </li></ol></li></ol></li><li> Quantification: <ol><li> Prendre des images des hémocytes installés sous un microscope à fluorescence (Figure 2B, D, F). Suivez avec quantification des hémocytes en utilisant le logiciel ImageJ. </li><li> Préparez-vous à l&#39;image ImageJ comptage cellulaire algorithme: <ol><li> Ouvrir l&#39;image des puits en utilisant ImageJ: Fichier → Ouvrir → (localiser le fichier et sélectionnez). </li><li> Assurez-vous que l&#39;image (s) est 8-bit ou 16-bit. Réglez le seuil de l&#39;image en sélectionnant l&#39;image puis cliquez sur Ajuster et sélectionnez Seuil. Observez la fenêtre &quot;Seuil&quot; (figure 3A). </li><li> Cochez l&#39;option &quot;Arrière-plan foncé&quot;. Sélectionnez &quot;Rouge&quot; et augmenter le niveau de seuil inférieur (voir flèche noire) jusqu&#39;à ce que chaque cellule dans l&#39;image est marquée d&#39;un point rouge (des cellules qui ne sont pas couverts on le verra en niveaux de gris; figure 3B). Comme le seuil inférieurest augmenté certaines cellules vont devenir banalisée. Cela peut être l&#39;indicateur de la façon dont la mesure de fixer le seuil inférieur. NOTE: Parfois amas de cellules ne peuvent pas être résolus et seraient comptés comme un seul par le compteur de particules. Dans de tels cas, le nombre de cellules dans un cluster peut être estimée en examinant l&#39;image (zoom avant si nécessaire) et le comptage manuel en utilisant un compteur de pointage. Alternativement, le seuil inférieur peut être augmentée pour résoudre des amas de cellules; toutes les cellules non marquées résultant de cette manipulation peuvent être comptées en utilisant un compteur de pointage. </li></ol></li><li> Analyser le nombre de cellules en utilisant ImageJ: <ol><li> Lancez l&#39;analyseur de particules de compter les cellules (figure 3C). Sélectionnez Analyser et cliquez sur Analyser particules. Vous pouvez éventuellement sélectionner &quot;Overlay Outlines&quot; pour voir les particules le compte de l&#39;algorithme (Figure 3D). Vous pouvez également définir une limite à la taille ou pixel de la zone d&#39;une unité (par exemple,., Cellulaire, amas de cellules, etc.) pour l&#39;algorithme de compter. </li><li> Cliquez sur OK. Observer une fenêtre de résumé avec le comte (figure 3E). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. hémocytaire Perturbation Assay <ol><li> Pour perturber hémocytes, sélectionnez les larves et les placer dans un tube à centrifuger de 2 ml avec environ 0,5 g de billes de verre (212 - 600 um) et ajouter 0,5 ml d&#39;eau. </li><li> Vortex le tube, à la main, à la vitesse de 10 pendant 1 min. </li><li> Récupérer les larves des perles de verre en renversant le contenu du tube à centrifuger dans une boîte de Pétri et à choisir les larves avec un pinceau. </li><li> Pour la phase de récupération, placez larves dans des boîtes de Pétri préalablement préparés avec de petites quantités de nourriture à la mouche. Laisser les larves de rétablir leur modèle hémocytaire pour une période de 45 min ou comme vous le souhaitez. REMARQUE: Jeter les larves qui ont cessé de bouger, car ils ont trouvé la mort dans le processus. Cependant, nous observons habituellement ldommages ittle après 1 min de vortex (voir ci-dessous et complémentaires Figure 1). </li><li> Après la période de récupération, continuer avec la purge / Scrape dosage comme décrit ci-dessus dans la section 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).</li><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thicker+than+blood:+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis.">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5, 673-690 (2003).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Gold, K. S., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates.">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).</li><li>Makhijani, K., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+blood+cells+and+the+nervous+system:+Hematopoiesis+in+the+Drosophila+larva.">Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva.</a> Fly. 6, 254-260 (2012).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138, 5379-5391 (2011).</li><li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila.">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230, 243-257 (2001).</li><li>Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+origins+of+hemocytes+in+Drosophila.">The two origins of hemocytes in Drosophila.</a> Development. 130, 4955-4962 (2003).</li><li>Sieweke, M. H., Allen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+stem+cells:+self-renewal+of+differentiated+macrophages.">Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages.</a> Science. 342, 1242974 (2013).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature immunology. 14, 986-995 (2013).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biology Open. 1-9, (2015).</li><li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation.">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> eLife. , (2015).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+blood+cells+function+as+a+surveillance+system+for+damaged+tissue+in+Drosophila+larvae.">Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).</li><li>Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+Drosophila+tetraspanin,+Tsp68C,+suppresses+the+abnormal+proliferation+of+ytr-deficient+and+Ras/Raf-activated+hemocytes.">Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes.</a> Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+hemocyte-specific+enhancer-reporter+transgenes+for+the+analysis+of+hematopoiesis+in+Drosophila+Genesis.">New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis.</a> 47, 771-774 (2009).</li><li>Gajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+crystal+cell-specific+enhancer+of+the+black+cells+prophenoloxidase+gene+in+Drosophila.">Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila.</a> Genesis. 45, 200-207 (2007).</li><li>Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Drosophila+hematopoietic+lineage+by+conserved+transcription+factors.">Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors.</a> Science. 288, 146-149 (2000).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).</li><li>Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sensing+of+systemic+and+nutritional+signals+by+haematopoietic+progenitors+in+Drosophila.">Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila.</a> Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ici, nous décrivons la première méthode pour récupérer quantitativement cellules sanguines circulantes et résidents du simple larves de drosophile, et de quantifier ces deux populations hémocytaires. Le protocole comprend la libération séquentielle de circulation et résidentes cellules sanguines, suivie par l&#39;imagerie et le comptage de cellules automatique. Hémocytes résidents larvaires peuvent être transitoirement mobilisés en circulation par les perturbations mécaniques, un processus qui est connu pour être largement inversée dans un 30 - min période de récupération de 60 6. Par conséquent, ce protocole a été testé dans deux façons, (1) en évaluant le nombre total de hémocyte par larve et la fraction de circulation hémocytes au cours du développement larvaire, et (2) en délogeant expérimentalement hémocytes résidents utilisant une méthode automatisée, qui a confirmé la corrélation étroite des hémocyte localisation et numéro de hémocyte dans la populations résidentes et de circulation. En outre, la reproductibilité de la méthode a été démontrée par la comparing deux ensembles de données de répétitions biologiques. Dans le passé, les laboratoires ont utilisé une gamme de techniques pour quantifier hémocytes larves 6,13,21. Ce protocole établit une norme commune pour récupérer et de quantifier les populations de cellules sanguines circulantes résidents et de larves de drosophile, en fournissant une plate-forme facilement adaptable. La méthode décrite est critique pour les études qui mettent l&#39;accent sur ​​le rôle des hémocytes résidents et leur microenvironnement, hématopoïétique poches 4-6, et est adapté pour étudier la protéine fluorescente souches de drosophile transgéniques porteurs de type sauvage et de milieux génétiquement modifiés. Le protocole est également pertinente pour les études qui mettent l&#39;accent sur ​​la mobilisation des hémocytes après la provocation immunitaire ou des blessures, et la signalisation génétiquement ou dues à l&#39;environnement qui déclenche la mobilisation des hémocytes résidents ou des changements de numéro de hémocyte totale (revue dans 4). Il est à noter que, dans le cas de di prématuréfferentiation et la libération des hémocytes de la glande lymphatique, en distinguant embryonnaire / larves par rapport lignées des ganglions lymphatiques peuvent être limitées par le profil d&#39;expression de la journaliste hémocytaire fluorescente utilisée. Le protocole présenté ici repose sur l&#39;imagerie en direct, hémocytes marqués par fluorescence. Dans le futur, il peut être modifié pour permettre la détection de cellules libérées après la fixation, par exemple, en utilisant l&#39;immunocytochimie. Dans ce cas, le protocole peut devoir être adapté pour assurer une adhérence complète des cellules sanguines, par exemple en augmentant les temps d&#39;adhérence d&#39;incubation, et l&#39;ajout d&#39;adhésif revêtement de glissement, par exemple la concanavaline A. Etant donné que le procédé permet la récupération des hémocytes et leur manipulation ex vivo, il bénéficiera d&#39;un large éventail d&#39;études biologiques et biochimiques de développement, cellulaires. Cellules de résidents et de sang circulant sont constatées lors de toutes les étapes de développement de la drosophile postembryonnaires et autres invertébrés, 22 suggesting que l&#39;adaptation de cette méthode bénéficiera d&#39;un large éventail d&#39;études au-delà du système hématopoïétique des larves de drosophile.

Recherche dans le modèle d&#39;invertébrés Drosophila melanogaster a entraîné la découverte de l&#39;immunité innée 1, et a facilité la compréhension des différents aspects du développement de globules 2-4. Drosophila hématopoïèse peut être divisé dans la lignée des hémocytes embryonnaires / larves, qui sont originaires de la embryon et se développer dans la larve, et la lignée des glandes lymphatiques hémocytes 4,5. Ici, nous présentons un protocole qui se concentre sur la lignée des hémocytes embryonnaires / larvaire, qui, dans la larve de drosophile comprend principalement plasmatocytes (macrophages) et quelques cellules à cristaux 4. Dans la larve, hémocytes de l&#39;embryon persistent et colonisent poches segmentaire répétées et terminaux hématopoïétiques (SPLI) situées entre l&#39;épiderme et les couches musculaires de la paroi du corps larvaire 5,6. Sur la base de leur nature que les macrophages d&#39;auto-renouvellement, leur résidence 6 prédominant dans microenvironnements tissulaires locales 6, 7, et leur lignée, dès les premiers globules émergents 6,8 au cours du développement, cette population de cellules sanguines est considéré comme similaire à des macrophages tissulaires d&#39;auto-renouvellement des vertébrés, une lignée myéloïde indépendant récemment identifiés dans une variété d&#39;espèces 4,9,10. Cependant, chez la drosophile, tout ou partie de ces cellules résidentes montrent également plasticité pour donner lieu à d&#39;autres types de cellules sanguines telles que des cellules de cristal 11,12. Hémocytes larvaires sont principalement résident (sessiles), mais sont dans un état d&#39;équilibre dynamique entre divers SPLI. Ils sont progressivement mises en circulation, en particulier la 3 ème stade larvaire approche de la nymphose 5-7. Défis immunitaires, de blessures ou mécanique perturbation plomb à un prématuré, dans le dernier cas réversibles, la mobilisation des hémocytes résidents dans l&#39;hémolymphe 4,6,13. Des études antérieures ont suggéré que résident et circulationhémocytes sont des larves de la même lignée, mais diffèrent dans leurs propriétés adhésives ou homing 6,7,13,14. Isolement sélectif de circulation par rapport hémocytes résidents a révélé des niveaux élevés de la prolifération dans la population hémocytaire résident, suggérant leur exposition à des indices inductives de la SPLI larvaires HPs 6. Drosophile sont bordées par l&#39;épiderme et les couches musculaires et du port davantage les groupes de neurones sensoriels du système nerveux périphérique (PNS) et la fonction hépatique ressemblant oenocytes 6. Fonctionnellement, les expériences d&#39;ablation de cellules mutantes et génétiques ont démontré que les neurones sensoriels présents dans la SPLI, supportent la survie trophique et la localisation des hémocytes larvaires 6. Nous décrivons ici un procédé pour l&#39;isolement et la quantification spécifique de résidents et les hémocytes circulant unique de larves de drosophile, et un protocole pour la mobilisation des hémocytes mécanique. Les procédés peuvent être utilisés pour l&#39;ex vivoétude des hémocytes et peut en outre être adaptée à d&#39;autres stades de développement chez la drosophile comme la nymphe et adulte, et d&#39;autres systèmes d&#39;invertébrés. Depuis les études précédentes ne distinguent pas entre les résidents et les hémocytes circulant, ce protocole fournit une norme commune pour l&#39;étude de globules résidents et aidera à renforcer la cohérence de la recherche sur les cellules du sang invertébrés. Premièrement, le hémocytaire purge / Scrape Assay décrit l&#39;isolement différentiel et la quantification automatique des fluorescente résident de protéine marqué et la circulation des populations hémocytaires de larves de drosophile unique; le protocole prévoit deux options pour microscopes réguliers et de tuiles scan-équipés (Figure 1). En conséquence, le pourcentage d&#39;hémocytes de circulation et le nombre total de larves par les hémocytes sont obtenus. La méthode repose sur des larves de Drosophila transgéniques qui expriment la protéine fluorescente entre leur globulespopulation. Le choix du pilote d&#39;hémocytes ou reporter détermine le résultat, à savoir, que la population de cellules sanguines est visualisée et quantifiée. Pour étiqueter principalement les macrophages (plasmatocytes), qui constituent la grande majorité de la population résidente et circulant hémocytaire de la larve de drosophile 6, transgènes appropriés comprennent Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXn -GAL4 16, CRQ-GAL4 (par H. Agaisse 16), ou mangeur-GAL4 17; pour l&#39;étiquetage de la relativement petite population de cellules de cristal, lignes appropriés sont BcF6-PCP et GFP 18, ou LZ-GAL4 (J. Pollock 19); pour lamellocytes d&#39;étiquetage, un type de cellule spécialisée principalement induite par les défis immunitaires et blessures 13, par exemple, MSNF9mo-mCherry peut être utilisé 17. Certains pilotes transgéniques sont exprimés dans une gamme différenciée de sanget les progéniteurs des cellules, comme il - 20 GAL4, qui marque environ 80% de toutes les cellules sanguines 20 larves. S&#39;il vous plaît noter que dans tous les cas où les conducteurs sont utilisés GAL4, combinaison avec UAS-GFP ou une autre protéine fluorescente UAS-transgène est nécessaire. Dans la section des résultats, cette méthode est utilisée pour surveiller le nombre de cellules du sang et le comportement de la circulation au cours du développement larvaire. Deuxièmement, le hémocytaire Perturbation Assay décrit une étape précédente conçu pour détacher hémocytes résidents par manipulation externe, ce qui permet par la suite de l&#39;évaluation de la capacité des hémocytes de ré-adhérer et à la maison à la SPLI dans un laps de temps limité (30 - 60 min) 6. Généralement, ce test est suivi par la purge / Scrape test pour déterminer le pourcentage de circulation hémocytes par larve. Nous présentons un protocole simplifié pour cet essai (figure 1D), qui utilise la perturbation par vortex espritperles h de verre, plutôt que la manipulation d&#39;une larve unique avec un pinceau comme décrit précédemment 6. Dans la section des résultats, ce test est utilisé pour démontrer que transitoirement détaché flotteur hémocytes dans l&#39;hémolymphe et peut être récupéré dans la fraction des hémocytes circulant. Le dosage est également utile pour quantifier les différences dans leur hémocytes de homing / adhérence aux sites de résidents, en comparant, par exemple, divers fonds génétiques ou des conditions de stimulation. S&#39;il vous plaît noter que cette manipulation mécanique reflète un processus réversible et est distincte de la mobilisation des hémocytes de résident Infection ou blessures induites, qui ne sont généralement pas réversibles dans un court laps de temps 4,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6cm/9cm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One for each genotype to be evaluated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water squirt bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spoon/spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. a &#34;liner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cavity dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila cell culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 1ml syringes with needles (27G &#189;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>For dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 212-600 micron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>One per genotype evaluating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: Hml&#916;-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or Hml&#916;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td>
			<td>Leica or Keyence</td>
			<td></td>
			<td>With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

Chez les vertébrés, l&#39;hématopoïèse est régulée par micro-environnements inductifs (niches). De même, dans le modèle d&#39;invertébrés organisme Drosophila melanogaster, des micro-environnements inductifs connus que des poches hématopoïétiques larvaires (HPS) ont été identifiés comme sites anatomiques pour le développement et la régulation des cellules sanguines (hémocytes), en particulier de la lignée macrophages auto-renouvellement. SPLI segmentaire répétée poches entre l&#39;épiderme et les couches musculaires de la larve, qui comprennent également les neurones sensoriels du système nerveux périphérique. Dans la larve, résidents (hémocytes) sessiles sont exposés à des anti-apoptotique, un adhésif et des indices de prolifération de ces neurones sensoriels et potentiellement d&#39;autres composants des HPs, tels que le muscle de revêtement et des couches epitheliales. Au cours du développement normal, libération progressive des hémocytes résidents de la SPLI carburants la population de hémocytes circulants, qui culmine dans la libération de most des hémocytes résidents au début de la métamorphose. Agressions immunitaire, une blessure physique ou perturbation mécanique déclenchent la libération prématurée de hémocytes résidents en circulation. Le commutateur de hémocytes larvaires entre les lieux de résidence et de circulation soulève la nécessité d&#39;une norme / procédure commune pour isoler sélectivement et de quantifier ces deux populations de cellules de sang de larves de drosophile unique. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode automatisée pour libérer et de quantifier le résident et hémocytes circulant à partir de larves unique. La méthode facilite les approches ex vivo, et peut être adaptée pour servir une variété de stades de développement de la drosophile et d&#39;autres organismes invertébrés.

Pour illustrer les résultats typiques des méthodes décrites, nous avons utilisé la première hémocytaire purge / Scrape Assay pour décrire la progression de numéros hémocytaires larvaires et leur résidence au cours du développement larvaire (Figure 4). Résident et circulant populations hémocytaires larvaires ont été isolés à partir de larves unique (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; He-GAL4 d&#39;étiqueter la grande majorité des hémocytes des larves) et quantifiée en utilisant ImageJ. Cohortes de larves dimensionnés 1,2 mm (~ 48 h AEL ou 1 er stade larvaire), 2,5 mm (~ 80 h AEL ou tard 2 ème stade), et de 3,5 mm (~ 96 h AEL ou 3 ème stade) ont été examinés (figure 4) . Numéros de hémocytaires élargi au cours du développement larvaire, en corrélation avec et dépassant les estimations précédentes basées sur la microscopie lumière de colorant teinté larves 7 et comptage direct de protéine marquée hémocytes fluorescentes à travers la cuticule des larves 6. Dans 1 st inslarves de goudron presque tous les hémocytes résidaient, tandis que la fraction des hémocytes circulant augmente progressivement au cours du développement larvaire (figure 4B, C), compatible avec les publications précédentes 6,7. Suivant nous avons examiné si la méthode surveille fidèlement la transition des hémocytes entre le résident et les populations circulent. Profitant du phénomène qui hémocytes résidents peuvent être transitoirement détachées par les perturbations mécaniques et ils ré-adhérer à leurs sites de résidents spontanément 6, nous nous sommes dispersés hémocytes résidents par vortex avec des billes de verre comme décrit dans le hémocytaire Perturbation Assay. En effet, la perturbation mécanique des larves a conduit à une augmentation spectaculaire de la population de circuler hémocytes au détriment des hémocytes résidents (Figure 5). Après une période de 45 min de récupération, les hémocytes se sont largement retournés à leur état adhérent, à la fois par inspection visuelle et par le quesessed pourcentage de cellules circulantes (figure 5D, E). Comme prévu, les numéros hémocytaires totales sont restées stables dans le temps, malgré le décalage des hémocytes circulant entre les populations et les résidents. Plusieurs considérations supplémentaires ont été prises en compte. Pour confirmer que vortex n&#39;a pas causer d&#39;importants dommages de tissu, vortex avec des billes de verre a été effectuée en présence de bleu Trypan (Sigma) pour diverses périodes de temps (1, 5, 20 min). Les deux 1 et 5 min vortex n&#39;a pas provoqué de rupture des tissus évidente, tandis que 20 min vortex a abouti à de petites zones de dommages, ressemblant dommages causés par les points de suture de l&#39;aiguille utilisée comme contrôle positif (Figure 1 supplémentaire). Alors que des dommages internes de l&#39;épiderme ou d&#39;autres tissus sans dommage de la cuticule ne peut être exclu, ce scénario semble peu probable que les hémocytes de 1 min et 5 larves re-adhéré le rythme attendu et le calendrier min-traitée, ce qui suggère l&#39;intégrité des larves n&#39;a pas été compromisd (Figure 1 supplémentaire). En revanche, les larves vortex pendant 20 min souffert d&#39;un manque de ré-adhérence, et n&#39;a même pas montrer l&#39;attachement de circulation hémocytes aux sites de l&#39;épiderme de la plaie, comme cela a été décrit précédemment 14. Enfin, afin de démontrer la reproductibilité de la méthode, nous avons comparé réplicats biologiques des larves de 2,5 mm à partir des deux expériences ci-dessus, qui ont été menées par les expérimentateurs distincts. Comme illustré sur la Figure 2 supplémentaire, les deux cohortes ont montré nombres totaux comparables d&#39;hémocytes par larve et le pourcentage d&#39;hémocytes circulants. T le test de Student a montré aucune différence statistiquement significative, ce qui suggère que la méthode est reproductible et largement applicable. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. hémocytaire purge / Scrape et Perturbation Assay s<html> ise et schématique. (A) simple Diapositive d&#39;image Configuration: cinq carrés de 2 mm pour l&#39;imagerie avec un objectif 5X (B) Tile Slide Setup numérisation:. Quatre places 3 mm pour l&#39;imagerie purge / éraflures de ≤2.5 mm larves avec un microscope de balayage de tuiles. Objectifs recommandés pour l&#39;imagerie sont 5X ou 10X. (C) Purger / Scrape Assay quantifications schématiques et résultant en utilisant ImageJ. (D) Dans la perturbation Assay, le motif de hémocyte est mécaniquement perturbé par vortex larves avec des perles de verre. Les larves sont autorisés à récupérer sur une période de 45 minutes au cours de laquelle hémocytes ré-adhérer aux poches hématopoïétiques. Les propriétés adhésives de hémocytes peuvent être évalués par cette méthode, quantifier le pourcentage de hémocytes en circulation après la perturbation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> moyens &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2. purge / Scrape Assay pour libérer de circulation et hémocytes résidents. (A) Pour purger une larve, incisions ventrales aux postérieurs et antérieurs extrémités de la larve sont faits (ciseaux symbole). (B) Hémocytes en circulation iront sur ​​les incisions et de régler sur la surface de la lame. (C) Le ganglion lymphatique (LG) est situé et clouée au sol, sans le percer. Hémocytes résidents sont libérés en donnant des coups et / ou gratter la larve avec une aiguille. Hémocytes (D) de résidents sur diapositive. (E, F) Le processus est répété jusqu&#39;à ce Grattez tous les hémocytes résidents sont libérés. La carcasse larvaire contenant le ganglion lymphatique intact est laissé pour compte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3. automatisé quantification des hémocytes utilisant ImageJ. (A, B) Après l&#39;ouverture d&#39;un fichier image hémocytaire dans ImageJ, le niveau de seuil inférieure est ajustée pour tenir compte de toutes les cellules de l&#39;image. (C, D) analyser des particules nécessite le réglage de la taille de pixel de la cellule, la circularité, et le résultat de lecture format (par exemple, Overlay Outlines). (E) fenêtre Résumé affiche le nombre de hémocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> Figure 4. Les résultats représentatifs (1). Numéro hémocytaire et l&#39;état résident sur<html> cours de développement larvaire. (A) Vue d&#39;ensemble des stades larvaires utilisés; 1 er stade (48 h AEL; ~ longueur de 1,2 mm); 2 ème (AEL 80 h; 2,5 mm de longueur) stade; 3 e stade (96 h AEL; ~ 3,5 mm de longueur). Génotype est Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Il GAL4. Étapes ont été confirmées par l&#39;évaluation mouthhooks larvaires. (B) du diagramme à barres de circulation et les numéros hémocytaires résident au stade larvaire respectifs. (C) Pourcentage de hémocytes circulant. Notez que la fraction des hémocytes circulant augmente de manière disproportionnée au cours du développement larvaire. (D) Total des hémocytes, résultant de la somme de circulation et hémocytes résidents par larve. Hémocytes ont été quantifiés en utilisant la méthode de purge / Scrape; n ≥ 6 larves / état, barres d&#39;erreur montrent écart type, les résultats confirmés en 3 expériences répétées indépendants.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> Figure 5. Les résultats représentatifs (2). Effets de la perturbation mécanique sur la résidence hémocytaire. (AC) Exemple de chenille avant et après vortex avec des billes de verre, suivi par 45 min recouvrement (A) n contrôle de perturbation. hémocytes sont localisées dans les poches hématopoïétiques (B) motif de hémocyte perturbé à 0 min après vortex larves dans une suspension de perles de verre et de l&#39;eau (C) motif hémocytaire à 45 minutes de récupération post-perturbation..; de nombreux hémocytes ont déménagé dans les poches hématopoïétiques; noter élargie dorsale-navire grappes associées et les rayures dorsales qui sont des sites prédominants de début de l&#39;après-perturbation accumulation (flèches). Génotype est Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Il GAL4-x YW. (D) Pourcentage de hémocytes quantifiés par la méthode de purge / Scrape circulation. (E) Total des hémocytes, résultant de la somme de circulation et hémocytes résidents par larve. n ≥ 4 larves / état, barres d&#39;erreur montrent écart type, les résultats confirmés en 3 expériences répétées indépendants. Test de student pour confirmer l&#39;importance, NS (non significatif), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva at JoVE.com

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Dosage des populations de cellules de sang de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

assaying-blood-cell-populations-of-the-drosophila-melanogaster-larva

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.1K vues.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Vidéo: Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

L&#39;élevage du Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sous axéniques et gnotobiotique Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Méthodes pour tester la perturbation endocrinienne dans le mélanogaster drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Capturer la réponse aux blessures cardiaques des populations cellulaires ciblées par l’imagerie tridimensionnelle du cœur effacé

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Génération d’une puce de barrière de sang-brain basée sur iPSC

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imagerie d’explants cérébraux vivants de larves de Drosophila melanogaster au troisième stade

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Pleins feux sur l’auteur : Étude de la dynamique de la division cellulaire asymétrique : un protocole pour l’imagerie en direct des explants cérébraux de larves de drosophile 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imagerie de cellules vivantes du cerveau larvaire du troisième stade de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...