Pour commencer, retirez les flacons FN-silk du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-les dans de la glace sèche pour le transport. Apportez les flacons dans une enceinte de sécurité biologique et placez-les dans un support de micro-tube de centrifugation. Lors de la décongélation, pipetez 550 microlitres de solution de soie dans chaque deuxième puits d’une plaque de 48 puits.
Placez le couvercle sur l’assiette et placez-le dans une boîte stérile. Transférez soigneusement la boîte de l’enceinte de sécurité biologique et laissez-la dans des conditions ambiantes pendant la nuit. Le lendemain, apportez la boîte contenant la plaque avec les membranes FN-silk et les inserts stériles dans l’enceinte de sécurité biologique.
Soulevez délicatement la plaque de la boîte, ouvrez le couvercle de la plaque et vérifiez visuellement la formation de la membrane en observant la turbidité dans les puits. À l’aide d’une pince à épiler stérile, prenez un insert et guidez-le vers le bas sur la membrane jusqu’à ce que les poignées touchent le haut du puits. Une fois que tous les inserts ont été abaissés, placez le couvercle sur la plaque et remettez la plaque dans la boîte stérile.
Laissez les membranes adhérer aux inserts pendant deux heures. Ensuite, retirez la plaque de la boîte et ouvrez le couvercle. À l’aide d’une pince à épiler stérile, retirez l’insert du puits.
Remplissez l’insert avec 100 microlitres de DMEM/F12 pour le semis basal, ou 200 microlitres pour le semis apical. Transférez l’insert dans un puits vide d’une plaque de 24 puits et remplissez le puits avec un millilitre de DMEM/F12. Après avoir récolté le nombre souhaité de kératinocytes humains, à l’aide d’une pipette P200, aspirez 20 à 50 microlitres de suspension cellulaire.
Dirigez la pointe de la pipette vers le centre de la membrane et appuyez lentement sur le piston de la pipette pour mettre la gouttelette en contact avec le milieu de culture à l’intérieur de l’insert. Une fois que toutes les membranes sont transférées, déplacez la plaque en forme de huit pour répartir les cellules uniformément sur les membranes. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
À l’aide d’une pince à épiler, soulevez les inserts de la plaque à 24 puits, en laissant le milieu de culture dans les puits. Ensuite, inversez l’insert de manière à ce que la face basale soit tournée vers le haut. Placez l’insert inversé dans la boîte de Pétri.
Aspirez 20 microlitres de suspension de cellules kératinocytaires humaines remises en suspension avec une pipette P200. Dirigez la pointe de la pipette vers le centre de la membrane et appuyez lentement sur le piston de la pipette pour former une gouttelette qui tombe sur la membrane. Placez le couvercle sur la boîte de Pétri.
Transférez la boîte de Pétri et la plaque à 24 puits contenant le milieu dans l’incubateur pendant 30 minutes. Après l’incubation, apportez la plaque à 24 puits et la boîte de Pétri dans l’enceinte de sécurité biologique. À l’aide d’une pince à épiler, choisissez un insert et retournez-le de sorte que le côté apical de la membrane soit orienté vers le haut et le côté basal vers le bas.
À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 200 microlitres de milieu de culture à l’intérieur de l’insert. Remettez l’insert dans un puits prérempli de la plaque à 24 puits. Cultivez les inserts à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Les kératinocytes cultivés sur la membrane FN-soie couvraient uniformément la surface et présentaient une morphologie de galets le premier jour. Les kératinocytes formaient une couche confluente au troisième jour, indiquant une fonction épithéliale, et formaient un réseau de jonctions serrées indiquant qu’ils assumaient des fonctions épithéliales physiologiques. Une grande viabilité cellulaire a été observée à travers les membranes de soie FN après trois jours, sans différence significative de viabilité entre le centre et la périphérie.
Le système de membrane FN-silk a soutenu une viabilité des kératinocytes similaire ou supérieure à celle des systèmes commerciaux de membrane PET.
