Pour commencer, extrayez l’ADN du tissu végétal et déterminez la concentration d’ADN. Configurez la réaction après avoir ajouté tous les composants requis dans un tube à centrifuger de 0,2 millilitre. Après l’amplification de l’amorce, chargez trois microlitres du produit PCR et deux microlitres d’un marqueur d’ADN de 5 000 paires de bases dans les puits d’un gel d’agarose.
Réglez la tension à 120 volts, le courant à 400 milliampères et exécutez l’électrophorèse pendant 40 minutes. Utilisez un système d’analyse d’images de gel polyvalent pour visualiser et analyser les résultats du gel. Après avoir exécuté l’exemple dans une unité de séquençage, sélectionnez Créer un nouveau projet et cliquez sur OK pour accéder à la page d’accueil du logiciel.
Dans le menu Fichier, sélectionnez Importer et ajouter des échantillons. Choisissez le fichier au format de trace de séquence et importez-le en tant que fichier à traiter sous les échantillons non assemblés. Choisissez Contig.
Ensuite, allez dans Assemblage avancé et sélectionnez Assembler en groupes. Lorsque la boîte de dialogue vous invitant à définir des noms s’affiche, modifiez le nom du fichier dans la section Définir le nom de l’échantillon des pièces, puis cliquez sur Assembler pour afficher la séquence alignée. Sélectionnez OK, puis Séquence de recherche et cliquez sur OK pour trouver la séquence correspondante.
Choisissez Contig, puis sélectionnez Supprimer pour supprimer les régions 5.8S et 28S, ainsi que toutes les séquences de mauvaise qualité. Exportez la sortie avec les séquences épissées pour la correspondance. Sélectionnez une recherche BLAST à l’aide de la base de données de nucléotides du NCBI.
Choisissez l’outil d’identification de l’espèce et l’amorce spécifique ITS-2, correspondant à la base de données mondiale sur le génome de la pharmacopée. Téléchargez des séquences de trois espèces d’Angelica et d’une espèce de Peucedanum praeruptorum en tant qu’exogroupe de NCBI. Analysez ces séquences ainsi que les séquences de résultats obtenues.
Cliquez ensuite sur Fichier. Sélectionnez Ouvrir un fichier ou une session pour importer le fichier et une boîte de dialogue apparaîtra. Choisissez Aligner suivi de l’ADN et sélectionnez Aligner par ClustalW pour la comparaison des séquences.
Accédez à phylogénie et cliquez sur Construire un arbre de jonction de voisin de test pour générer un arbre phylogénétique. Les résultats de l’électrophorèse sur gel ont montré des bandes claires uniques d’environ 500 paires de bases pour les échantillons AS1, AS2 et AS3, sans bandes dans le contrôle négatif, indiquant une amplification réussie de l’ADN extrait. Les résultats du séquençage ont permis d’identifier Angelica sinensis avec une similarité de séquence de 100 % à l’aide de BLAST, ce qui correspond aux résultats de la base de données GPGD.
Dans l’analyse phylogénétique, les séquences d’épissage se sont regroupées avec Angelica sinensis OR8797150.1, avec une valeur de support bootstrap de 100, prouvant l’identification comme Angelica sinensis.
