Ici, nous fournissons un flux de travail qui comprend la meilleure méthode bioinformatique pour mener les expériences afin d’évaluer l’effet du glyphosate sur les microbiomes. Le principal avantage est qu’il fournit une hypothèse testable robuste pour de futures expériences sur le terrain et en laboratoire. La méthodologie décrite peut être appliquée à une variété de systèmes, y compris les plantes, les animaux et les microbes.
Chaque partie de la méthodologie est assez simple. La partie la plus difficile est peut-être d’intégrer une équipe multidisciplinaire capable d’effectuer différentes parties du travail. Suni Matthew, un chercheur de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, commencez l’expérience un en divisant le champ expérimental en 10 répliques de contrôle et de traitement GBP avec des bandes tampons de végétation entre les parcelles. Traiter les parcelles témoins avec de l’eau du robinet et les parcelles GBP avec du GBP commercial pour imiter la dose maximale autorisée de glyphosate dans les pratiques agricoles. Échantillonnez le microbiote à partir de plantes expérimentales.
Prélever 10 répliques des échantillons de plantes sur le terrain, les placer immédiatement sur la glace et les apporter au laboratoire pour un traitement ultérieur. Pour la deuxième expérience, collectez des litières, y compris des copeaux de bois, des excréments et des aliments renversés provenant de cailles nourries avec des aliments contaminés par gbp ou contrôlez-les dans une volière de 12 mois. Envoyez les échantillons de litière à un laboratoire accrédité pour les mesures de concentration de glyphosate directement après sa propagation.
Plantez des graminées vivaces et des fraisiers dans chaque parcelle pour étudier leur microbiote racinaire et foliaire. Identifier et éliminer les microbes endophytes en lavant et en stérilisant les échantillons de plantes. Une fois les échantillons stérilisés, extrayez l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN végétal disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant.
En utilisant une approche imbriquée, amplifier les régions variables V6 à V8 du gène de l’ARNr 16S et faire un mélange maître PCR pour le nombre requis d’échantillons comme décrit dans le manuscrit textuel. Pour le premier tour de PCR, utilisez les amorces 799 vers l’avant et 1492 vers l’arrière. Configurez le profil d’amplification dans le thermocycleur pendant 35 cycles.
Pour vérifier l’amplification, effectuez une électrophorèse à l’aide de cinq microlitres de produit amplifié, puis diluez les 25 microlitres restants du produit PCR dans de l’eau ultrapure autoclavée dans un rapport de un à 10. En utilisant les amorces universelles 1062 avant et 1390 arrière, effectuez le deuxième tour d’amplification avec 25 cycles. Diluer les produits PCR obtenus dans de l’eau ultrapure autoclavée à un rapport égal.
Effectuez le troisième tour d’amplification avec huit cycles pour étiqueter les produits avec les codes-barres et la séquence d’adaptateur p1. Vérifier la concentration en qualité des produits de PCR sur un bioanalyseur et regrouper les volumes constituant 30 nanogrammes d’ADN de chaque échantillon dans un tube de 1,5 millilitre pour préparer une bibliothèque équimolaire. Sélectionnez les amplicons de taille 350 à 550 paires de bases par fractionnement de taille à l’aide d’un système automatisé de sélection de la taille de l’ADN sur une cassette de gel d’agarose.
Recueillir l’élute contenant les amplicons de la taille spécifiée dans un flacon dans la cassette, ce qui donne une bibliothèque de gènes d’ARNr 16S purifiée. Transférer l’éluant collecté dans un tube de 1,5 millilitre et vérifier la pureté et la concentration sur le bioanalyseur. Diluer la bibliothèque d’ADN à l’aide d’eau ultrapure autoclavée jusqu’à une concentration finale de 26 picomolar.
Pour amplifier la région ITS, après avoir configuré la réaction avec des amorces ITS, réglez le profil d’amplification sur le thermocycleur. Ensuite, analysez cinq microlitres du produit amplifié sur du gel d’agarose à 1,5% et diluez les 25 microlitres restants du produit dans un rapport de un à 10 en utilisant de l’eau ultrapure autoclavée. Créez un mélange maître PCR pour le nombre requis d’échantillons avec des amorces avant marquées par code-barres et des amorces inverses marquées par adaptateur P1.
En utilisant le produit PCR dilué comme modèle, effectuez la deuxième série d’amplification. Semblable à la préparation de la bibliothèque pour le gène de l’ARNr 16S, préparez la bibliothèque pour la région ITS purifiée. Initier les analyses bioinformatiques de la séquence protéique EPSPS.
Évaluer la sensibilité potentielle de la séquence de requête au glyphosate à partir des sorties fournies par le serveur où la première sortie montre la fraction de marqueurs d’acides aminés présents dans les séquences de requête et le nombre de motifs. La sortie deux montre les alignements de la requête et des séquences de référence en fonction des résidus de marqueurs. La troisième sortie affiche des alignements complets par paires des séquences de requête et de référence.
La quatrième sortie montre des séquences de référence EPSPS de Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis et Streptomyces davawensis. À la fin de la page de sortie, recherchez des liens vers des outils externes tels que BLASTp et des domaines conservés pour analyser plus en détail la séquence EPSPS de requête. Après avoir identifié les séquences EPSPS à partir des référentiels publics, accédez à ces jeux de données à partir de la page principale du serveur de classes EPSPS contenant des informations taxonomiques et de la classe EPSPS de plus de 50 000 séquences.
Peser la biomasse aérienne des plantes à la fin de la saison sur le terrain pour comparer la croissance des plantes en GBP et en parcelles de contrôle. Dans une feuille de calcul, cartographiez les OTU bactériens pour les expériences de microbiome dans des ensembles de données pré-calculés. Et sur la base d’un score probabiliste, calculez la sensibilité intrinsèque au glyphosate.
Cette méthode a été utilisée pour quantifier les changements de sensibilité dans la protéine EPSPS à un niveau micro évolutif. Nous avons identifié des changements dans le statut de sensibilité dans 12 des 32 groupes étroitement apparentés de procaryotes analysés. Ainsi, l’utilisation continue des produits à base de glyphosate peut produire une dysbiose microbienne dans les microbiomes végétaux, animaux et du sol.
Assurer la qualité des procédures pré et post-PCR pour obtenir des bibliothèques amplicon optimales. Assurez-vous également que la séquence protéique EPSPS n’est pas partielle avant d’utiliser le logiciel. Lors d’expériences sur le terrain, assurez-vous d’éviter la contamination des contrôles par le glyphosate.
