L’empreinte génétique est un outil courant en sciences biologiques et appliqué aux tests de paternité, ainsi qu’aux études médico-légales ou phylogénétiques. Ce protocole est conçu pour fournir aux étudiants de premier cycle les principes de base de la prise d’empreintes génétiques dans les cours de laboratoire. Il est basé sur le locus humain D1S80, un nombre variable de régions de répétitions en tandem, dont les allèles peuvent différer en longueur entre les individus.
L’extraction de l’ADN, la PCR, l’électrophorèse sur gel et l’analyse ultérieure peuvent être difficiles à effectuer, surtout si elles sont effectuées pour la première fois. La démonstration visuelle de toutes les étapes permet aux spectateurs d’observer la pratique générale, les détails et les précautions qui doivent être prises lors de la mise en œuvre de ce protocole très robuste. Pour extraire l’ADN des cellules épithéliales de la muqueuse buccale, commencez par récolter les cellules à l’aide d’un écouvillon buccal stérile.
Utilisez un écouvillon pour frotter vigoureusement à l’intérieur de la joue pendant 30 à 40 secondes. Placez la pointe de l’écouvillon de collecte dans le tube de micro-centrifugeuse stérile étiqueté et cassez la longueur de plastique qui s’étend au-delà du bord, puis fermez le tube. Préchauffer un bloc chauffant à 65 degrés Celsius et préparer tous les tampons et solutions nécessaires.
Ajouter 500 microlitres de solution de lyse à l’écouvillon, en vous assurant que l’échantillon est complètement immergé dans la solution de lyse et vortex l’échantillon pendant au moins cinq secondes. Incuber l’échantillon pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius et vortex de temps en temps. Après incubation, retirez l’écouvillon en le pressant contre la paroi du tube pour obtenir un volume d’échantillon maximal.
Ajouter 100 tampons de daturation microlitres aux cellules de lyse et bien mélanger en inversant le tube jusqu’à ce qu’un précipité blanc devienne visible. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante, puis centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 17, 950 G.Transférer 450 microlitres du surnageant dans un tube micro-centrifugeuse propre de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 450 microlitres d’iso 2-propanol et mélangez bien en inversant le tube pour précipiter l’ADN.
Incuber pendant cinq minutes à température ambiante et centrifuger pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et inversez le tube sur une serviette en papier propre et séchez le granulé. Lavez l’ADN avec 500 microlitres d’éthanol à 70%, centrifugez peu de temps pendant une minute et jetez le surnageant.
Pour sécher complètement la pastille, incuber l’échantillon pendant cinq minutes à 65 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Enfin, ajoutez 30 microlitres de tampon d’élution et incuber pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius pour inactiver le système d’ADN. Préparez le mélange maître en ajoutant le tampon PCR vert, les DNTPs, les amorces, l’eau et la polymérase au tube de micro-centrifugeuse.
Étiquetez les tubes PCR avec les numéros d’échantillon et aliquotez 45 microlitres du mélange principal PCR à chaque tube PCR. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’ADN ou, pour le contrôle sans gabarit, ajoutez de l’eau. Fermez les tubes PCR et centrifugez-les brièvement.
Placez les tubes dans le cycleur thermique et démarrez le programme PCR. Une fois le programme terminé, conservez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils traitent davantage. Préparez un gel d’agarose à 1,5% en pesant 1 1/2 gramme de poudre d’agarose et en le mélangeant avec 100 millilitres de solution tampon TAE dans une bouteille.
Chauffer soigneusement le mélange d’agarose au micro-ondes et faire tourbillonner le mélange entre les deux jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissous. Sachez que des retards d’ébullition peuvent survenir. Après un court refroidissement du mélange d’agarose, ajoutez deux microlitres de vert Pec.
Versez le gel et utilisez un peigne avec suffisamment de puits pour les échantillons. Après polymérisation complète du gel d’agarose, chargez les puits avec 10 microlitres de chacun des échantillons PCR et ajoutez un étalon de poids moléculaire aux puits flanquants. Faire fonctionner le gel à 150 volts pendant environ 40 minutes.
Pour visualiser les produits PCR, imagez le gel à l’aide de la lumière ultraviolette. Pour l’analyse des allèles D1S80 amplifiés, placez une règle à côté de la norme de poids moléculaire en commençant par les puits sur l’image du gel photographique. Mesurez la distance pour chaque bande de l’étalon de poids et enregistrez les longueurs dans un programme de calcul de table.
Ensuite, déterminez le logarithme de chaque taille de fragment de l’étalon de poids. Insérez un nuage de points à l’aide de tailles de fragments standard transformées en log et les distances mesurées par rapport à votre gel. Ajustez une courbe de tendance et affichez l’équation de régression et la valeur R carrée.
Dans un nouveau tableau, insérer les distances de mesure entre les amplicons PCR et les puits. Pour déterminer la taille de ces amplicons, utilisez l’équation de régression de la régression linéaire et calculez l’antilogue pour obtenir les tailles de fragments en paires de bases à partir des amplicons. Enfin, attribuez les unités de répétition de 16 paires de bases à chaque amplicon mesuré.
L’extraction de l’ADN et l’amplification du lieu D1S80 ont été réussies pour tous les individus étudiés, et le contrôle sans gabarit dans la voie 10 n’a montré aucun amplicons. De l’analyse de longueur de fragment, les individus ont été classifiés en étant homozygotes ou hétérozygotes avec deux allèles. Le nombre d’unités de répétition des répétitions en tandem était clairement relatable, et peut maintenant servir pour une analyse plus approfondie.
Nous décrivons ici une méthode simple et rentable pour mettre en œuvre l’empreinte moléculaire dans les cours pratiques de premier cycle. L’ensemble de la procédure peut être complété en une seule journée de travail et comprend quatre étapes différentes. Dans un premier temps, le modèle d’ADN est préparé.
Les cellules épithéliales buccales sont récoltées par prélèvement par écouvillonnage. Les écouvillons oraux sont un outil fiable pour fournir une quantité et une qualité suffisantes de cellules pour l’extraction de l’ADN. De plus, le protocole d’extraction de l’ADN n’utilise pas de solvants organiques, ce qui est avantageux dans les classes de laboratoire de premier cycle.
La première étape peut être complétée en 90 minutes ou moins. Dans un deuxième temps, le locus D1S80 est amplifié par PCR. Les conditions de PCR présentées ici sont robustes même en cas de mauvaise qualité du modèle d’ADN.
Cette étape peut être effectuée en 2 heures et demie. Les produits PCR sont ensuite analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. L’électrophorèse sur gel d’agarose présente de nombreux avantages par rapport à d’autres techniques, telles que l’évitement des composants dangereux et une technique de préparation simple.
Cette analyse peut être effectuée en 90 minutes. Après l’électrophorèse, les résultats de la longueur du fragment peuvent être analysés en 90 minutes par analyse de régression linéaire, soit effectuée à l’aide d’un programme de calcul de table, soit à l’aide d’une simple calculatrice. En résumé, la méthode d’empreintes digitales présentée peut être utilisée dans des pratiques pratiques pour enseigner l’utilisation des marqueurs moléculaires et son application en science biologique.
