Nous remercions les membres Lab Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Rong Li, Qin Wan, Congxiao Zhang, Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova pour les aider à la caractérisation de ces cultures de cellules. Un merci spécial à Jing Zhao, Connie Zhi, et Tina Banzon pour leur aide dans le maintien de stocks importants de cultures cellulaires. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health Research Programme intra-muros.

1. Tissu foetal humain Toutes les recherches tissus humains liés suit les principes de la Déclaration d&#39;Helsinki et le conseil d&#39;examen institutionnel NIH. Yeux du fœtus sont obtenus par une proxénète indépendante, Advanced Bioscience Ressources (ABR, Alameda, Californie), à ​​partir de donneurs choisis au hasard à 16 à 22 semaines de gestation, placés dans un milieu RPMI-1640 contenant des tubes (fournis par l&#39;ABR), emballés sur glace, et livrés par un service de livraison prioritaire pendant la nuit. Les tissus restent viables jusqu&#39;à 48 heures après l&#39;énucléation. 2. Milieu de culture cellulaire MEM-alpha milieu modifié (Sigma-Aldrich) est utilisé comme milieu de base pour préparer 5% et 15% de sérum contenant des supports de culture des cellules de l&#39;EPR (moyenne RPE; tableau 1 ci-dessous). <table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Montant </td><td> Stockage </td></tr><tr><td> MEM, l&#39;alpha de modification </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> N1 complément </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Acides aminés non essentiels </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> * THT </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurine </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortisone </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 ug </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> Fœtal bovin ** sérique </td><td></td><td></td><td> 5% ou 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Fœtal humain composants du milieu EPR pour la préparation de 500 ml de milieu THT * est faite en dissolvant la taurine-hydrocortisone-triiodo-thyronin en 1 de 1,5 mL de PBS avant de prendre la moyenne. Aliquotes multiples sont faites et stockées à -80 ° C à simplifier la préparation de culture du milieu de culture. ** Sérum fœtal bovin n&#39;est pas obtenue chez Sigma-Aldrich ou Gibco. Sérum fœtal bovin utilisé dans la préparation des médias est obtenu à partir d&#39;Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Chaque bouteille de sérum est inactivé par la chaleur (56 ° C pendant 1h) avant utilisation. Pour assurer la cohérence des montants de culture de cellules grandes de sérum provenant du même lot sont achetés et stockés dans -20 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient utilisés pour la préparation des supports. Cellules clairsemée ensemencé à partir d&#39;un lot spécifique de cellules sont cultivées dans hfRPE 24 - ou 12 - plaques ainsi pendant quelques semaines dans un milieu contenant 20% de FBS de lots différents. Les cellules les plus dynamiques melanated avec la morphologie RPE plus classique (pavés) indiquent un terrain approprié sérum qui peut être utilisé pour la culture cellulaire. Milieu de culture cellulaire contient également: N1 supplément (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, glutamax / pénicilline-streptomycine 1:100 mL / mL (Gibco), et non essentiels solution d&#39;acides aminés (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL. En outre, l&#39;hydrocortisone (20 mg / L), de la taurine (250 mg / L), et triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) est préparée à l&#39;avance par la dissolution de ces trois composantes dans le PBS à une concentration finale de 1:500 (ml / ml). Des aliquotes de THT sont stockés à 80 ° C jusqu&#39;à ajoutés au milieu de l&#39;EPR. 3. Culture de cellules Dès réception, les globes intacts sont rincés dans une solution antibiotique antifongique (dilué 10X;.. Réf 15240-096; Invitrogen) plus gentamicine (1 mg / ml) pendant 3 à 5 minutes (voir figure 1 ci-dessous). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Après une incubation d&#39;antibiotiques sont rincées deux fois avec support tel que HBSS ou PBS. Un globe oculaire à l&#39;époque est transféré à 10 cm boîte de Petri avec des enduits de Sylgard-184 (WPI) et sécurisé avec 27G aiguilles. En utilisant un couteau à blanc Sideport (Alcon), une incision est faite à travers la sclère en dessous du corps ciliaire (1 / 3 de la distance de l&#39;équateur oeil à la face antérieure). Cette incision est utilisée pour démarrer une découpe circulaire pour l&#39;enlèvement de la partie antérieure de l&#39;œil. Cette coupe est faite en utilisant un revêtement de carbure de tungstène courbes ciseaux à iris avec une lame dentelée (FST). Avant l&#39;enlèvement de la partie antérieure de l&#39;œil, une coupe est faite à travers le corps vitré pour éviter de détacher la retina de l&#39;EPR au pôle postérieur. Après la partie antérieure de l&#39;œil est enlevé, le pôle postérieur est incubée avec dispase-I solution (2 U / mL, n ° 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) dans 5% de sérum de milieu contenant pendant 40-60 minutes à 37 ° C-CO 2 5%. Après le traitement dispase, les pôles postérieurs sont transférés à une HBSS en boîtes de Petri avec du silicone rembourrage (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) et disséqués en quadrants ou de plus grands morceaux de tissus suffisamment aplatir. Puis la rétine est délicatement retiré avec une pince. Couches RPE unicellulaires ont été décollée en feuilles et collectées directement en froid trypsine-EDTA (Gibco, # 25200-056) solution. Après l&#39;EPR sont collectées, les tubes avec les tissus de la trypsine-EDTA sont scellés et transférés dans un bain d&#39;eau pendant 10-15 minutes à 37 ° C. Après 10 min d&#39;incubation, les tubes sont secoués vigoureusement pour séparer les EPR en petites grappes. Si la séparation n&#39;est pas complète, les tubes sont replacés dans un autre bain d&#39;eau pendant 5 mn. Après la trypsine-EDTA incubation, les tubes sont inspectés pour d&#39;éventuelles non-dissous amas de cellules mixtes. Tout amas observés sont enlevés à l&#39;aide fines pointes pipette Pasteur en verre. Après filer vers le bas (1,4 RPM sur centrifugeuse clinique pendant 4 minutes), les cellules hfRPE sont remis en suspension dans les médias RPE 15% et ensuite mis dans des flacons Primaria (exemple: cat pas 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Ce milieu est remplacé après un jour avec un milieu de RPE 5% de sérum contenant, et les modifications ultérieures ont été faites tous les 2 à 3 jours. Après 3 à 4 semaines, les cellules deviennent confluentes et uniformément pigmentés. Elles sont ensuite traitées à la trypsine à 0,25% de trypsine-EDTA pour les 10 à 15 minutes, remises en suspension dans 15% de sérum contenant un milieu de culture cellulaire RPE, et ensemencées sur des clairs inserts de culture cellulaire de 150 à 200K cellules par puits (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), utilisant des plaquettes de diamètre de 12 mm, pores de 0,4 um, les membranes de polyester (exemple: cat pas 07-200-161, Fisher Scientific)... Avant le semis, les puits ont été revêtus de la matrice extracellulaire humaine (10 ug dans 150 ul par puits HBSS, n ° 354237;.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) et guéri par la lumière UV dans le capot pendant 2 heures. Dans certains cas, la procédure de traitement à la trypsine a été répété pour une deuxième fois, pour recueillir les cellules qui ne se détachent pas après la trypsinisation premier. Le même protocole (hors revêtement avec ECM) a été utilisé pour des cellules en culture sur les flacons de générer de la population de cellules P1. Ces cellules ont été utilisés dans des expériences où ils avaient une résistance des tissus au total ≥ 200 Ω • cm 2 et ont été uniformément pigmentés. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour agrandir la figure 1</a> . 4. Etape par étape les procédures <ol><li> Préparer à 12 puits plaque avec des solutions multiples (pour chaque oeil 4 puits nécessaire): <ol class="lalpha"><li> Ajouter 10x solution antibiotique antifongique - 1 puits / les yeux </li><li> Ajouter PBS / HBSS solution pour rincer - 2 puits / les yeux </li><li> ajouter la solution dispase - 1 puits / les yeux </li></ol></li><li> Préparer la dissection boîte de Petri par le déballage 5 aiguilles de fixation et de le remplir avec du HBSS </li><li> Déballez les yeux et les placer dans antibiotiques antimycosiques solution pour 3-5 minutes (préparé à l&#39;étape 1) </li><li> Rincer les yeux dans les deux puits (préparé à l&#39;étape 1) avec du PBS / HBSS, puis de les transférer à disséquer plat. </li><li> Garniture musculaire excessive et les tissus conjonctifs autour de l&#39;oeil </li><li> Utiliser des aiguilles 27G sécurisé (épingler au silicium de base) les yeux dans la dissection plat en les alignant dans un chemin où la cornée vers le haut. </li><li> Aide d&#39;un couteau faire une incision Sideport ci-dessous la cornée, où découpe circulaire va commencer </li><li> Avec des ciseaux iris font coupées autour de l&#39;œil, puis l&#39;aide de ciseaux couper à travers la même vitreux et soulever la portion antérieure de l&#39;oeil loin. Remarque: dans les étapes 3 à 8 éviter toute pression excessive mécanique globe oculaire. </li><li> Transfert yeux ouverts dans la solution dispase (préparé à l&#39;étape 1) </li><li> Incuber œilleton pendant 40-60 minutes à 37 ° C avec 5% de CO 2 </li><li> Remplacer solution HBSS à disséquer plat avec un nouveau. </li><li> Transfert des yeux de la solution dispase à plat de dissection. </li><li> Position dans l&#39;œil boîte de Pétri (tasse globe oculaire vers le haut) et le fixer avec deux aiguilles 27G. </li><li> Soulevez doucement la rétine partiellement séparés et coupés avec des ciseaux la rétine rétine loin du nerf optique. Jeter rétine. </li><li> Avec des ciseaux iris faire une incision de la périphérie de l&#39;œil vers le nerf optique. </li><li> Utiliser tous les cinq aiguilles 27G aplatir la couche RPE oeil faisant bien tendue. </li><li> Avec des ciseaux rétiniennes font coupées circulaire autour du nerf optique qui sépare la couche RPE de l&#39;attachement à nerf optique. Remarque: les étapes 13 à 17 peut être fait avec un faible grossissement ou sans microscope stéréoscopique </li><li> Ajustez le grossissement 250x stéréomicroscopeou plus et de trouver bord de la feuille EPR à proximité du nerf optique le long de la coupure faite par les ciseaux à iris. </li><li> En utilisant deux pinces membrane séparée RPE-Bruch de la couche de tissu choroïdien. Elle peut exiger un peu de tentatives pour trouver des zone le long du bord où la connexion de l&#39;EPR et la choroïde est la plus faible. </li><li> Placer dans des feuilles RPE froide trypsine-EDTA solution dans tube de 15 ml </li><li> Après l&#39;EPR sont recueillis, des tubes à bouchon et le transfert des tissus dans la trypsine-EDTA dans le bain d&#39;eau pour 10 à 15mn à 37 ° C. </li><li> Après 10 min d&#39;incubation, agiter vigoureusement tubes de 15 ml de séparer l&#39;EPR en petites grappes. Si la séparation n&#39;est pas complète, placer les tubes de retour dans le bain d&#39;eau pendant 5 mn. </li><li> Inspectez les tubes pour d&#39;éventuelles non-dissous amas de cellules mixtes. Tout amas observés doivent être retirés à l&#39;aide fines pointes pipette Pasteur en verre. </li><li> Isoler (1,4 RPM sur centrifugeuse clinique pendant 4 mn) hfRPE cellules, enlever le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 15% des médias RPE (9 mL au total) </li><li> Mettez 3 ml de suspension cellulaire dans des flacons Primaria ajouter 2 mL de Fresh Media RPE 15%, flacon placer dans pépinière jusqu&#39;au lendemain (37 ° C, 5% CO 2) </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Validation fonctionnelle de la culture cellulaire hfRPE Dans les expériences précédentes, nous avons utilisé ces cultures primaires de déterminer l&#39;expression, la polarisation et la fonction des protéines plasmatiques de transport membranaire et d&#39;identifier des voies de signalisation qui régulent la fonction EPR 1-11 Ces caractéristiques car elles sont accumulées fournir un ensemble de validation des propriétés qui peuvent être appliquées à chaque génération cellulaire. Les expériences résumées ci-dessous identifier les protéines qui déterminent le transport transépithélial du liquide et l&#39;intégrité de la voie paracellulaire. Ces expériences in vitro ont été validés dans un modèle animal de la rétine nouveau rattachement 6. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Localisation de la protéine CFTR dans les cellules hfRPE panneau supérieur gauche:. CFTR a été détecté dans les cellules en utilisant une membrane hfRPE enrichi d&#39;extraits. M, marqueur de poids moléculaire; piste 1, les principales matures (bande C) et immatures (bandes A et B) Panneau central faible: la localisation par immunofluorescence de la protéine CFTR (étiquette verte) Haut panneau de droite: vue agrandie en coupe par le plan z montrant.. intensité maximale de projection à travers l&#39;axe z. ZO-1 (étiqueté comme rouge) sert de marqueur de jonctions serrées délimitant les côtés apical et basolatéral de l&#39;EPR. DAPI (bleu) les étiquettes des noyaux situés à proximité de la membrane basale. ZO-1 apparaît comme jaune / orange, car la fluorescence de ses chevauchements label rouge vert de la protéine CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. IFN induit des changements physiologiques dans hfRPE A:. Ajout de IFN au bain basale accrue de transport de fluides transépithélial (J v) à travers des monocouches primaires, des cellules en culture hfRPE J v est tracé en fonction du temps dans la trace en haut et fluide net. d&#39;absorption (apicale à bain d&#39;basale) est indiqué par des valeurs positives; potentiel transépithélial (TEP) et la résistance des tissus au total (R T) sont tracées en fonction du temps dans les traces du bas. B: Ajout de CFTRinh-172 (5 um) pour le bain basale inhibé l&#39;IFN-J v stimulé augmenter. Voici un exemple d&#39;expériences modèles animaux confirment hfRPE résultats in vitro. Dans cette expérience, créées artificiellement décollement de la rétine a été considérablement réduite après l&#39;addition de IFNg à la surface de l&#39;œil extérieur (Figure 4 A, B). Cet effet peut être partiellement bloquée par: (1) ajout de bloqueur AMPc (figure 4D), (2) a complètement bloqué après ajout de bloqueurs JAK AMPc +. Images ci-dessous sont obtenus en utilisant scanner octobre <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Expériences in vivo décollement de la rétine. Les procédures pour ces expériences in vivo ont été précédemment décrit en détail 6. Dans ces expériences, décollement de la rétine ont été créés dans l&#39;oeil de rat par injection de 0,5-3 ul de PBS modifiés solution dans l&#39;espace sous-rétinien (SRS), seul ou avec une combinaison de JAK-STAT et inhibiteurs de la voie PKA. Chaque expérience était une période de contrôle initial de 40-70 min après la création du décollement de rétine. Pendant ce temps, le taux de variation de volume de bulle a été mesurée afin d&#39;assurer la stabilité bulle. Tomographie par cohérence optique d&#39;imagerie (Institut de Physique Appliquée de l&#39;Académie russe des sciences, de Nijni-Novgorod, en Russie) a été utilisé pour mesurer l&#39;évolution temporelle de la variation de volume dans SRS. Le cours du temps de re-attachement volchangement de UME a été mesuré par tomographie par cohérence optique (OCT). Images OCT de 4 expériences différentes (panneaux sur la gauche; AD) qui montrent un changement dans les tailles de détachement (flèches en A, B et D) après l&#39;ajout de IFN à la surface antérieure de 40 à 70 min. Les panneaux A et B montrent que IFN augmenté Jv de son taux de contrôle (≈ 2 pl • cm 2 • h -1) à 14 et 12 cm 2 ul • • h-1, respectivement. Après ajout de la voie JAK-STAT et de la PKA de la sérotonine (C et D), l&#39;IFN - Les taux d&#39;absorption induites ont été significativement réduite à 0,2 et 7,9 cm 2 ul • • h-1, respectivement. Les flèches indiquent la limite de la bulle pour la comparaison avec la zone délimitée à l&#39;intérieur de la ligne pointillée, (volume de départ). Le côté droit de la figure: en haut du panneau-sommaire des taux Jv mesuré à partir de plusieurs expériences; milieu du panneau-film ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">cliquez ici</a> ); panneau inférieur 3D-sections d&#39;expérience résumée dans B. PseudoColor en bleu indique l&#39;étendue spatiale de détachement à l&#39;instant t = 0 et 40 min après l&#39;addition de INFγ. Toutes les expériences animales ont été menées en conformité avec l&#39;Association for Research in Vision et la déclaration d&#39;ophtalmologie. Le protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation des National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

Dans les présentes expériences, nous décrivons des modifications supplémentaires de nos techniques déjà publié 3 conçu pour simplifier les multiples étapes nécessaires à la production cohérente hfRPE cultures primaires avec un nombre élevé de cellules disponibles pour chaque œil. Chaque changement dans la procédure initiale a été rigoureusement testés dans la physiologie et de multiples expériences de biologie moléculaire afin de s&#39;assurer que les changements ne pas introduire d&#39;artefacts et d&#39;être constamment testée par de nombreux autres laboratoires utilisant ces cellules. Enfin, des expériences complémentaires ont été effectuées pour comparer les résultats obtenus in vitro à des perturbations similaires dans des modèles animaux.

Instruments nécessaires pour le protocole de dissection <ol><li> Microscope stéréo - tout disponible avec un grossissement x250 de travail nécessaire pour la dissection </li><li> Vaisselle dissection - par exemple, Kimble 100 x 20mm # 23062 (un par dissection) de toute source </li><li> Sylgard 184 - Cat WPI. # SYLG184 * * Pour préparer dissection plat suivi Sylgard 184 inclus les instructions de mélange, verser le liquide dans mélangés élastomère boîte de Pétri pour former la couche 5-8mm. Autoriser élastomère pour guérir au moins 24 heures. Plat avec élastomère durci peuvent être stérilisés à l&#39;aide d&#39;éthanol à 70% et réutilisés plusieurs fois (~ 100 fois) </li><li> 27 aiguilles G de BD PrecissionGlide une longueur de ¼ (5 par dissection) de toute source </li><li> HBSS 1X Solution contenant Ca et Mg des sels - Cat # 14025 GIBCO 500ml (bon pour les dissections multiples). </li><li> Ciseaux Iris carbure de lame dentelée, incurvé - FST Cat # 14559-11 (un). </li><li> Ciseaux rétinienne - Katena Cat # K4-5300 (un). </li><li> Pince - par exemple, Dumont # 5 Brucelles avec pointes polies de Cat # 500085 WPI (2 pièces). </li><li> Couteau Sideport - Alcon, coupe à blanc 1mm, Biseau double, Cat # 8065921540 angle. </li><li> Centrifuger le tube 15ml - (une par œil) de toute source </li><li> Pasteur en verre pipette - (un par dissection) de toute source </li><li> Plaque 12 puits (un par dissection) de toute source </li><li> Primaria 25cm 2 flacon - (2-3 par œil) de toute source </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Nous avons développé une procédure de culture cellulaire qui peut produire de grandes quantités de monocouches confluentes de fœtus humains primaires de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (hfRPE) les cultures avec des caractéristiques morphologiques, physiologiques et génétiques de la RPE humaine native. Ces cultures de cellules pigmentaires présentent hfRPE lourds, et la microscopie électronique montrent vaste microvillosités membrane apicale. Les complexes de jonction ont été identifiés avec l&#39;étiquetage immunofluorescence des différentes protéines de jonctions serrées. Polarité épithéliale et la fonction de ces cultures facilement reproductible primaires ressemblent déjà étudié les modèles de mammifères de l&#39;EPR indigènes, y compris humaines. Ces résultats ont été étendues par le développement d&#39;interventions thérapeutiques dans plusieurs modèles animaux de la maladie de l&#39;œil humain. Nous nous sommes concentrés sur les stratégies pour l&#39;élimination de l&#39;accumulation de liquide anormal dans la rétine ou de l&#39;espace sous-rétinien. L&#39;espace extracellulaire sous-rétinienne sépare les segments externes des photorécepteurs et la membrane apicale de l&#39;EPR et est essentiel pour l&#39;entretien des pièces jointes de la rétine et une multitude de RPE / rétine interactions.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Nous fournissons une méthode reproductible pour la culture des monocouches confluentes de cellules foetales humaines épithélium pigmentaire rétinien (hfRPE) cellules qui présentent la morphologie, la physiologie, la polarité et de protéines et les profils d&#39;expression génique du tissu natif adulte. Ce travail a été étendue à un modèle animal de plusieurs maladies oculaires.

Modèles expérimentaux pour l&#39;étude de la physiologie épithélium pigmentaire rétinien et physiopathologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K vues.  National Institutes of Health. Nous fournissons une méthode reproductible pour la culture des monocouches confluentes de cellules foetales humaines épithélium pigmentaire rétinien (hfRPE) cellules qui présentent la morphologie, la physiologie, la polarité et de protéines et les profils d'expression génique du tissu natif adulte. Ce travail a été étendue à un modèle animal de plusieurs maladies oculaires.

Vidéo: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Recherche

Neurosciences

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbal injection Approche-sous-rétinienne de vecteurs viraux pour la thérapie génique chez la souris épithélium pigmentaire rétinien

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Élaboration d’un protocole raffiné pour Trans-sclérale Transplantation sous-rétinienne des cellules épithéliales humaines pigmentaire dans les yeux de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection du postconditionnement acide contre l&#39;ischémie cérébrale

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Caractérisation et dynamique morphologique de l’EPR primaire murin en culture

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Pleins feux sur l’auteur : Isolement efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires de souris adultes pour la recherche sur la rétinopathie

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...