Les troubles liés à l’EPR restent une partie importante du mélange des maladies, mais sans restes efficaces dans la culture virtuelle de cellules primaires de l’EPR pour servir de bon modèle pour les études physiologiques et pathologiques des troubles liés à l’EPR. Dans ce protocole, nous fournissons un protocole facile à suivre pour la culture de CPI primaires, qui pourrait rapidement restaurer et maintenir les caractéristiques RP ultérieures, nous croyons qu’en utilisant cette méthode, les gens pourraient rapidement générer des cellules RP à partir d’études de macistate et de criblages de médicaments protecteurs qui pourraient faciliter le développement de nouveaux traitements pour les troubles RPE. Une démonstration étape par étape de la valeur rendra cette méthode beaucoup plus facile à reproduire dans différents laboratoires qui souhaitent étudier les cellules RP.
Pour commencer à décongeler l’enzyme de digestion tissulaire malaquad et stériliser 1X PBS. Complété par 2% de pénicilline et 2% de streptomycine en filtrant la solution à travers une unité filtrante à seringue de 0,22 micromètre. Lavez les puits de la plaque de culture et des inserts transwell avec 1X PBS.
Retirez le PBS des puits et des puits avec une pipette et ajoutez un millilitre de PBS 1X frais dans la chambre inférieure et 600 microlitres de solution de laminine de 10 microgrammes par millilitre dans la chambre supérieure. Incuber les plaques et les inserts transwell dans cet incubateur hélicicole pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après cela, retirez la solution stratifiée de la chambre supérieure et lavez deux fois avec un millilitre de PBS 1X froid avant d’asseoir la cellule Nettoyez la hotte d’écoulement du stratifié avec de l’éthanol à 75% et de la lumière UV.
Préparez trois tubes de centrifugation stériles de 50 millilitres contenant environ 25 millilitres d’éthanol à 75%, trois tubes de centrifugation stériles de 50 millilitres contenant environ 25 millilitres de 1X PBS et trois boîtes de culture cellulaire stérile de 10 centimètres contenant environ 15 millilitres de 1X PBS. Trempez quatre globes oculaires porcins dans environ 15 millilitres d’éthanol à 75% dans une boîte de Petri de 10 centimètres et utilisez une paire de ciseaux et de pinces pour couper tous les tissus conjonctifs et les muscles résiduels. Pour décontaminer les globes oculaires, faites tremper et lavez quatre globes oculaires dans trois tubes centrifugés stériles de 50 millilitres remplis séquentiellement d’éthanol à 75%.
Ensuite, lavez les globes oculaires dans trois tubes centrifugés stériles de 50 millilitres remplis de 1X PBS séquentiellement. Inversez les tubes toutes les minutes pour bien laver les globes oculaires. Déplacez les quatre globes oculaires dans une boîte de culture cellulaire stérile de 10 centimètres contenant 1X PBS.
Coupez à nouveau la surface externe de chaque globe oculaire pour enlever le nerf optique et les petits débris. Utilisez des ciseaux pour faire une petite coupure à l’intersection du limbe et de la sclérotique. Et puis retirez la cornée, l’iris, le cristallin, le corps vitré et la rétine neurale.
Transférer le complexe de sclérotique choroïde RPE dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 10 centimètres et faire quatre coupes pour aplatir la coupelle oculaire en forme de trèfle à quatre feuilles. Effectuer des voyages dans la digestion de la solution d’EDTA en plaçant les quatre complexes de sclérotique choroïde RPE dans un nouveau plat de 10 centimètres et en versant 20 millilitres de solution d’EDTA de trypsine fraîche pour fusionner les complexes de sclérotique choroïde RPE. Placez le plat dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant près de 30 minutes.
Après 30 minutes, sortez la capsule de l’incubateur et ajoutez 20 millilitres de milieux de culture cellulaire préchaudes avec 10% FBS dans la boîte. Pour neutraliser les déclenchements en solution d’EDTA, utilisez une pipette de transfert de cinq millilitres pour dissocier les cellules EPR en pipetant doucement plusieurs fois. Recueillir les suspensions cellulaires dans des tubes centrifuges de 15 millilitres, puis pipeter doucement 10 millilitres supplémentaires de milieux de culture frais avec FBS pour laver les complexes de sclérotique RPE Choroids sur le plat.
Recueillir les cellules EPR en centrifugeant les tubes à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le SuperAgent à l’aide d’une pipette et ajouter cinq millilitres supplémentaires de milieux de culture avec FBS pour remettre les cellules en suspension. Centrifuger à 300 G pendant encore cinq minutes.
Décanter le SuperAgent et remettre les cellules en suspension avec 12 millilitres de milieux de culture. Prochaine graine de 100 000 à 200 000 cellules par puits dans 12 plaques de culture de puits ou inserts transwell. Changez les milieux de culture tous les deux jours et réduisez la concentration sérique à 1% lorsque les cellules couvrent complètement la surface des puits par insert.
Changez les milieux de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient récoltées. Les images représentatives des cellules EPR porcines primaires du deuxième jour, du sixième jour et du jour 10 sont présentées ici. L’analyse QRTPCR des niveaux d’ARNm des gènes de signature dans les cellules RPE porcines primaires, les cellules RPE humaines primaires, les cellules ARPE 19 et le tissu choroïde RPE porcin est détectée par cette image graphique.
Ici, GAP DH a été utilisé comme gène d’entretien pour RTPCR. Quatre réplicas biologiques ont été utilisés pour les cellules EPR porcines primaires et une cellule EPR 19 où trois réplicas biologiques ont été utilisés pour les cellules EPR humaines primaires et le tissu choroïde EPR porcin. Les niveaux d’expression génique dans les cellules ARPE 19 ont été définis comme témoins.
L’analyse sanguine occidentale des protéines RPE 65 dans les cellules ARPE 19 et porcines RPE et dans les cellules RPE humaines primaires et les tissus choroïdes RPE porcins est illustrée dans cette figure. Le vinculin était utilisé ici comme contrôle de chargement. Cette figure montre une culture de deux semaines de cellules EPR porcines dans un milieu DMEM Basic avec 1% FBS.
Les cellules cultivées avec ou sans Lamin ont été colorées avec RPE 65, APTA sodium-potassium, Z01 et Hex. Les mesures TR dans des feuilles cellulaires, cultivées avec ou sans laminine sont représentées dans cette figure. L’analyse sanguine occidentale du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire ou VEGF et du facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire ou PEDF dans les cellules RPE porcines primaires et ARPE 19 est illustrée dans cette figure.
Les fonctions sectorielles des cellules RPE porcines primaires en culture et ARPE 19 sont présentées dans ces images. La grande partie de ce protocole consiste à dissoudre les cellules RP des complexes gliaux chides RPE. Nous recommandons d’utiliser des voyages frais et une solution à chaque fois et de contrôler correctement le temps de digestion, pour dissoudre huit cellules RP.
