L’un des défis de la recherche rétinienne est d’étudier la diaphonie entre différentes cellules, telles que les neurones rétiniens, les cellules gliales et les cellules vasculaires. En particulier, l’isolement et la culture des neurones rétiniens sont difficiles. Nous pensons que l’explant rétinien en culture peut surmonter cette limitation et offrir un système ex vivo unique qui nous permet d’étudier la diaphonie entre différentes cellules rétiniennes, sous des paramètres biochimiques bien contrôlés et indépendamment du système vasculaire.
En outre, un explant de la rétine est un outil de dépistage important pour étudier de nouvelles interventions pharmacologiques dans diverses maladies rétinovasculaires et neurodégénératives, telles que la rétinopathie diabétique, caractérisée par des lésions vasculaires et neuronales. Notre laboratoire étudie les changements physiopathologiques favorisant le dysfonctionnement rétinien microvasculaire depuis des années. L’utilisation d’une grande variété de modèles, y compris des modèles in vivo et in vitro, nous a permis d’optimiser de nombreuses techniques à l’intérieur de notre laboratoire.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour les explants rétiniens dérivés d’une souris adulte de type sauvage qui peut être maintenue en culture pendant deux semaines. Gardez les animaux logés sous température constante et dans un environnement contrôlé par la lumière. Inspectez chaque animal pour la santé, la nourriture adéquate et l’eau.
Assurez-vous de fournir aux animaux de la nourriture fraîche et de l’eau propre. Changez les cages souillées quotidiennement ou au besoin pour la santé des animaux. Utilisez 6 souris noires mâles âgées de plus de 12 semaines.
Euthanasier les animaux dans leur cage domestique par inhalation de surdose de dioxyde de carbone. Après avoir terminé la procédure, confirmer la mort de l’animal par une méthode appropriée, telle que la confirmation de l’arrêt cardiaque et respiratoire ou l’observation des pupilles fixes et dilatées de l’animal. Suivre la confirmation du décès par une méthode secondaire d’euthanasie telle que la luxation cervicale.
Appliquez une pression sur l’orbite à l’aide de pinces incurvées jusqu’à ce que le globe fasse saillie. Fermez doucement la pince sur la partie postérieure de l’œil et élevez-la dans un mouvement continu. Plongez le globe oculaire dans un tube de 1,5 millilitre contenant un HBSS glacé d’un millilitre.
Transférer le globe oculaire dans un tube de 1,5 ou deux millilitres contenant un média complet. Maintenant, il est prêt pour la dissection. Ce diagramme illustre les étapes consécutives qui seront montrées pour disséquer le globe oculaire de la souris afin de créer l’explant rétinien.
L’incision circonférentielle est faite le long du limbe pour ouvrir le globe oculaire. La cornée est enlevée par dissection le long de l’incision limbique. La lentille et le vitré sont ensuite retirés, laissant une coupelle oculaire vide.
En tenant la région de la tête du nerf optique avec la pince fine, le décollement de la couche externe de l’œil est effectué en douceur. Une grande attention lors de l’enlèvement de la couche extérieure afin de ne pas blesser la rétine neurale et d’avoir la rétine totalement intacte. Ensuite, la rétine sera coupée en morceaux plus petits.
Ce sera un grand avantage, car cela vous permettra d’avoir une expérience où votre groupe témoin et vos groupes expérimentaux sont dérivés du même animal. Cependant, couper la rétine en petits morceaux rendra sa manipulation plus difficile. Par conséquent, nous avons développé une technique pour manipuler ces petites pièces rétiniennes afin d’assurer une bonne orientation de la culture de la rétine.
Allez avec la lame de ciseaux de dissection ouverte juste en dessous de la pièce rétinienne. Élevez lentement la pièce rétinienne avec la pointe d’une lame de ciseaux ouverte et transférez-la doucement sur la plaque de culture. Les explants seront transférés séparément sur des inserts de culture cellulaire dans des plaques multipuits, chacune contenant 300 microlitres de milieux d’explantation rétiniens avec le côté de la rétine neurale tourné vers le haut.
Les cultures d’explant rétiniens seront maintenues dans des incubateurs humidifiés à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Assurez-vous que la surface rétinienne est orientée vers le haut. Si la pièce rétinienne est retournée ou pliée, essayez de l’ajuster doucement à la bonne orientation.
Ne pas placer l’explant rétinien dans la bonne orientation avec la rétine neurale tournée vers le haut entraînera l’échec de la croissance correcte des cellules rétiniennes en culture. Ici, nous pouvons voir l’immunofluorescence colorer les explants rétiniens colorés en culture pendant deux semaines. Les explants ont été fixés et colorés avec NeuN pour les neurones rétiniens, GFAP pour les cellules gliales et lectine pour les vaisseaux sanguins.
La coloration a montré des cellules rétiniennes et des vaisseaux rétiniens bien développés. Ici, nous pouvons voir une coloration par immunofluorescence des explants rétiniens fixés et colorés avec GFAP pour les cellules gliales et lectine pour les vaisseaux sanguins. Les images montrent une coloration défectueuse et un sous-développement des cellules rétiniennes et des vaisseaux rétiniens.
En effet, l’explant rétinien était plié et n’était pas orienté correctement sur la plaque de culture. Une grande attention doit être portée à la bonne orientation de l’explant avec la rétine tournée vers le haut. Le fait que le groupe témoin soit dérivé du même animal que le groupe traité présente un grand avantage à avoir une comparaison plus fiable des différentes conditions expérimentales.
Les implants rétiniens peuvent fournir une plate-forme décente pour étudier les cibles thérapeutiques possibles pour une grande variété de maladies rétiniennes, telles que la rétinopathie diabétique et les maladies dégénératives de la rétine.
