Nous remercions les membres du laboratoire Tuschl des discussions utiles. MH est soutenu par le Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de Grant # 3100A0-114001 à MZ; TT est un enquêteur HHMI, et de travailler dans son laboratoire a été financée par des subventions du NIH et de GM073047 MH08442 et la Fondation Starr.

Le protocole ci-dessous décrit la procédure de PAR-Clip pour cellules HEK293 exprimant DRAPEAU / HA-taggés IGF2BP1 lors de l&#39;induction par la doxycycline. Nous allons utiliser un anticorps anti-FLAG pour immunoprécipitation. PAR-Clip fonctionnera avec n&#39;importe quel lignée cellulaire exprimant des niveaux détectables de l&#39;endogène, sans étiquette ARN protéine de liaison (RBP) d&#39;intérêts si un anticorps efficace pour immunoprécipitation est disponible. Cellules Expansion <ol><li> Développer FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellules dans un milieu de croissance. Nous vous recommandons d&#39;utiliser entre 100 à 400 x 10 6 cellules (environ 10 à 40 cm 15 assiettes de culture cellulaire) comme point de départ. Cultivez-les à environ 80% de confluence. </li><li> 14 h avant réticulation ajouter un) 4-thiouridine à une concentration finale de 100 uM (1:1000 v / v d&#39;un M 1 4-thiouridine solution stock) directement au milieu de culture cellulaire et b) induire l&#39;expression de l&#39;indicateur / HA taggés IGF2BP1 par addition de 1 ug / ml de doxycycline (1:10.000 v / v de 10 mg / ml solution stock doxycycline). REMARQUE: au lieu de 4-thiouridine vous pouvez également utiliser 100 uM de 6-thioguanosine. </li></ol> Réticulation UV <ol><li> Laver les cellules une fois avec 10 ml PBS glacé par plaque et retirez PBS complètement. </li><li> Placez les plaques sur un plateau avec de la glace et irradier découverts à 0,15 J / cm 2 de 365 nm de lumière UV dans un Stratalinker 2400 (Stratagene) ou un appareil similaire. </li><li> Racler les cellules off avec une spatule en caoutchouc dans 1 ml de PBS par plaque, le transfert de 50 tubes de centrifugation ml et recueillir par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant. 100 x 10 6 cellules HEK293 (10 15 cm plaques) donnera environ. 1 ml de cellule humide de granules. </li><li> (Optionnel) Sauf si vous voulez continuer directement avec la lyse cellulaire, choc geler les cellules dans l&#39;azote liquide et stocker granulés à -80 ° C. Les culots cellulaires peuvent être conservés pendant au moins 12 mois. </li></ol> Lyse cellulaire et RNaseT1 digérer <ol><li> Relevez culot cellulaire de cellules réticulées dans 3 volumes de tampon de lyse NP40 1x et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Lysat à cellules claires par centrifugation à 13000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Effacer le lysat encore en le filtrant à travers un filtre à membrane de 0,2 um seringue (Acrodisc Pall ou équivalent). </li><li> Ajouter ribonucléase T1 (Fermentas, 10000 U / pl) à une concentration finale de 1 U / pl et incuber dans un bain-marie pendant 15 min à 22 ° C. Refroidir la réaction par la suite pour 5 min sur la glace avant de procéder. </li></ol> Immunoprécipitation et la récupération des fragments d&#39;ARN cibles réticulé Utiliser le séparateur magnétique Suivez ces directives tout au long de la préparation de l&#39;échantillon pour empêcher les billes magnétiques de se dessécher. <ol><li> Placer le tube contenant les billes sur le support magnétique pour 1 2 minutes. </li><li> Ajouter le tampon dans le tube alors que le tube est sur le séparateur magnétique. </li><li> Boucher le tube, le retirer du séparateur magnétique, et remettre en suspension les perles. Vous pouvez remettre en suspension les perles en feuilletant le tube avec votre doigt ou d&#39;utiliser un Vortexer fixé à 5 6. </li><li> Centrifuger brièvement pour ramasser toutes les billes qui peuvent rester dans le bouchon du tube. </li><li> Répétez les étapes 1 à 4 selon les besoins. </li></ol> Préparation des billes magnétiques <ol><li> Transférer 10 ul de particules magnétiques Dynabeads protéines G (Invitrogen) lysat par cellule ml (pour une expérience typique elle devrait être d&#39;env. 40 50 ul de billes) à un tube de 1,5 ml. Lavez perles deux fois avec 1 ml de tampon citrate-phosphate. </li><li> Remettre en suspension dans un volume double de tampon citrate-phosphate par rapport au volume initial de billes en suspension. </li><li> Ajouter 0,25 pg d&#39;anti-FLAG anticorps monoclonal M2 (Sigma) par ml de suspension et incuber sur une roue en rotation pendant 40 min à température ambiante. </li><li> Lavez perles deux fois dans 1 ml de tampon citrate-phosphate pour éliminer l&#39;anticorps non liés. </li><li> Remettre les billes dans le double du volume de tampon citrate-phosphate par rapport au volume initial de billes en suspension. </li></ol> Immunoprécipitation (IP), deuxième RNase T1 digestion, et la déphosphorylation <ol><li> Ajouter 20 ul d&#39;anticorps fraîchement préparés conjugués des billes magnétiques par ml de lysat partielle RNase T1 cellule traitée et incuber dans 15 ml tubes de centrifugation sur une roue en rotation pendant 1 h à 4 ° C. </li><li> Recueillir des billes magnétiques sur un collecteur de particules magnétiques de 15 et 50 tubes de centrifugation ml (Invitrogen) et le transfert des tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. </li><li> Lavez perles 3 fois dans 1 ml de tampon de lavage IP. </li><li> Ajouter RNaseT1 (Fermentas, 10000 U / pl) à une concentration finale de 100 U / ul et incuber la suspension de billes dans un bain-marie pendant 15 min à 22 ° C. Refroidir la suite sur la glacependant 5 min. </li><li> Lavez 3 fois en perles de 1 ml de tampon de lavage haute-sel. </li><li> Perles Remettre en suspension dans 1 volume de tampon de déphosphorylation </li><li> Ajouter phosphatase intestinale de veau alcaline (CIAP, ONE) à une concentration finale de 0,5 U / pl, et incuber la suspension pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Lavez perles fois dans 1 ml de tampon de lavage phosphatase </li><li> Laver deux fois en perles kinase (PNK) tampons polynucléotide sans DTT (la concentration la TNT nécessaires à la réaction enzymatique est suffisamment élevée pour endommager les billes magnétiques). </li><li> Resuspendre perles perles en un seul volume initial de tampon PNK </li></ol> Le marquage des segments d&#39;ARN aux protéines réticulées immunoprécipité <ol><li> Pour la suspension de billes décrites ci-dessus, ajouter Υ-32 P-ATP à une concentration finale de 0,5 pCi / ul et T4 PNK (ONE) à 1 U / ul dans un volume de billes d&#39;origine. Incuber la suspension pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter ATP non radioactif pour obtenir une concentration finale de 100 uM et incuber pendant encore 5 min à 37 ° C. </li><li> Laver les billes magnétiques 5 fois avec 800 pl d&#39;PNK tampon sans TNT. </li><li> Resuspendre les perles dans 70 ul de tampon de chargement SDS-PAGE. </li></ol> SDS-PAGE et électroélution des réticulé ARN-protéine complexes à partir de tranches de gel <ol><li> Incuber la suspension radiomarqué pendant 5 min dans un bloc chauffant à 95 ° C pour dénaturer et la libération de la RBP immunoprécipités avec l&#39;ARN réticulé et vortex. </li><li> Retirez les billes magnétiques sur le séparateur et le transfert du surnageant dans un tube de centrifugeuse propre de 1,5 ml. </li><li> Charge 40 ul du surnageant par puits d&#39;une Novex Bis-Tris à 4-12% (Invitrogen) en gel de polyacrylamide préfabriqué et exécuter le gel pendant 55 min à 200 V. </li><li> Démonter la chambre de gel et de démanteler le gel, la laissant monté sur une plaque. Pour faciliter l&#39;alignement du gel à l&#39;impression sur papier phosphorimager, nous recommandons l&#39;implantation de trois minuscules morceaux de gel radioactifs asymétrique à trois des quatre coins du gel. Morceaux de gel radioactifs peuvent être recueillies à partir de gels qui ont été précédemment utilisé pour purifier radiomarqué oligonucléotides synthétiques. Envelopper le gel dans un film plastique (par exemple, Saran) pour éviter toute contamination. </li><li> Exposer le gel d&#39;un écran blanchi phosphorimager pendant 1 h et de visualiser sur un phosphorimager. </li><li> Aligner le gel sur le dessus de l&#39;impression phosphorimager utilisant les morceaux de gel implanté pour l&#39;orientation. Découpez les bandes qui correspondent à la taille attendue de la RBP (IGF2BP1, env. 75 kDa) et transférer dans un tube D-Tube dialyseur Midi et ajouter 800 ul 1x tampon SDS cours d&#39;exécution. </li><li> Electroelute réticulé ARN-RBP complexes en 1x SDS courir tampon à 100 V pendant 2 h. excisés du gel et électro dans un Midi D-Tube dialyseur (Novagen) dans 800 pi de tampon SDS fonctionne selon les instructions du fabricant. </li></ol> Protéinase K digestion <ol><li> Ajouter un volume égal de tampon 2x protéinase K par rapport à la electroeluate, suivie par l&#39;ajout de protéinase K (Roche) à une concentration finale de 1,2 mg / ml. Incuber pendant 30 min à 55 ° C. </li><li> Récupérer l&#39;ARN par acides phénol / chloroforme / IAA d&#39;extraction (25:24:1, pH 4,0), suivie par une extraction au chloroforme. Ajouter 1 l de glycogène (10 mg / ml stock) précipiter l&#39;ARN en ajoutant 3 volumes d&#39;éthanol. Dissoudre le culot dans l&#39;eau 10,5 pi. </li></ol> la préparation d&#39;ADNc et le séquençage de profondeur Réaliser l&#39;ARN récupérés par un protocole standard d&#39;ADNc préparation décrit à l&#39;origine pour le clonage de petits ARN régulateurs 19. La première étape, la ligature adaptateur 3 &#39;, a été réalisée comme décrit sur une échelle de 20 ul avec 10,5 ul de l&#39;ARN récupérés. Utilisez le séquençage Solexa adaptateur ensembles décrits. Selon la quantité d&#39;ARN récupérés, 5&#39;-adaptateur-3&#39;-adaptateur de produits sans inserts peuvent être détectées après amplification de l&#39;ADNc par PCR comme des bandes supplémentaires. Dans de tels cas, le produit d&#39;accise plus de PCR de taille attendue à partir d&#39;un NuSieve 3% à faible point de fusion gel d&#39;agarose, éluer le produit de PCR à partir des morceaux de gel en utilisant le kit GelElute (Qiagen) et la séquence en utilisant la technologie Solexa. Un séquençage Solexa courir offre habituellement entre 6 et 10 millions de séquences qui sont assez lit pour une couverture du transcriptome gamme de sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN. Analyse bioinformatique Attention analyse bioinformatique de la séquence de lit doit être fait pour obtenir un aperçu significatif dans les sites pour la liaison à l&#39;ARN RBP examinés, tels que l&#39;élément de reconnaissance d&#39;ARN, les régions préférées liant le RBP a (exonique vs intronique, séquence codante vs non traduite séquence). La séquence lit doivent être alignés contre les bases de données du génome et de l&#39;Est. Nous utilisons habituellement lit Mapping unique dans le génome avec jusqu&#39;à un décalage, l&#39;insertion ou la suppression de construire des grappes de la séquence lit qui peuvent ensuite être analysés ultérieurement. La fréquence des mutations caractéristiques de la grappe séquencé lit, T pour les transitions C en utilisant 4-SU et G à A transitions en utilisant 6-SG, sont révélateurs de séquences avec succès réticulé. Dans notre expérience, les ARN non réticulé étiquetés avec 4-SU montrent un taux de mutation de fond d&#39;environ 20%. Ce taux est augmente à env. 50-80% sur la réticulation. Une description détaillée de l&#39;analyse bioinformatique peut être trouvée dans le matériel supplémentaire de la publication par Hafner et al. 18 Étapes facultatives Détermination du taux d&#39;incorporation de 4-thiouridine en ARN total Isoler l&#39;ARN total à partir de la lignée cellulaire exprimant de façon stable le RBP d&#39;intérêt après plus en milieu supplémenté avec 100 uM 4SU 16 h avant la récolte. Comme contrôle, la récolte des cellules cultivées sans ajout 4SU. Isoler l&#39;ARN total par addition de 3 volumes de réactif Trizol (Sigma) pour les culots lavés suivant les instructions du fabricant. était encore purifier l&#39;ARN total en utilisant Qiagen RNeasy selon le protocole du fabricant. Pour éviter l&#39;oxydation des 4SU pendant l&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;analyse, ajouter 0,1 mM dithiothréitol (DTT) pour les tampons de lavage et ultérieures étapes enzymatiques. Digest et déphosphorylé ARN total à nucléosides unique pour l&#39;analyse HPLC comme décrit avant le 20. Brièvement, dans un volume de 30 ul, incuber 40 ug d&#39;ARN total ont été purifiées pendant 16 h à 37 ° C avec 0,4 U de phosphatase alcaline bactérienne (biochimique Worthington) et 0,09 venin de serpent U phosphodiestérase (Worthington Biochemical). En tant que norme de référence, utiliser un ARN de synthèse 4SU marqué, (nous en standard l&#39;utilisation CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) et également l&#39;objet de compléter la digestion enzymatique. Séparez les mélanges résultant de ribonucléosides par HPLC sur une découverte Supelco C18 (phase greffée de particules de silice uM 5, 250 x 4,6 mm) colonne en phase inverse (Bellefonte PA, USA). Tampons HPLC sont 0,1 M dans l&#39;acétonitrile TEAA 3% (A) et 90% d&#39;acétonitrile dans de l&#39;eau (B). Utilisez un gradient isocratique: 0% de B pendant 15 min, 0 à 10% de B pendant 20 min, 10 à 100% de B pendant 30 min. Appliquer un B 5 min à 100% lavez appliquée entre les courses pour nettoyer la colonne HPLC. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Figure 1" /> La figure 1 (droite) montre un résultat représentatif d&#39;une PAR-Clip réalisé avec des lignées cellulaires exprimant DRAPEAU / HA-taggés avec 4 IGF2BP1-SU et 6-SG. Notez que l&#39;efficacité de réticulation de la 6-SG pour IGF2BP1 est inférieur au rendement de réticulation pour 4-SU. L&#39;efficacité plus faible réticulation se traduira par un fond plus élevé des séquences dérivées de fragments d&#39;ARN cellulaires abondants et donc vous devriez considérer élargissement de l&#39;expérience lors de l&#39;utilisation moins efficace nucléosides photoréactif. Le panneau de gauche de la figure 1 montre une comparaison de l&#39;utilisation de différents analogues de l&#39;uridine photoréactif qui pourrait être potentiellement utilisé pour PAR-Clip rapport aux traditionnels UV 254 nm de réticulation. L&#39;intensité de la bande radioactive de la bonne longueur vous donne une bonne idée si l&#39;expérience PAR-Clip a travaillé et que vous avez isolé l&#39;ARN suffisantes pour mener à bien un petit protocole de séquençage de l&#39;ARN (étape par étape pour la préparation de la description banque d&#39;ADNc de petites séquençage des ARN peut être trouvée dans 19). La fréquence des mutations caractéristiques de la lecture séquencé, T pour les transitions C en utilisant 4-SU et G à A transitions en utilisant 6-SG, sont révélateurs de séquences avec succès réticulé. Dans notre expérience, les ARN non réticulé étiquetés avec 4-SU montrent un taux de mutation de fond d&#39;environ 20%. Ce taux est augmente à env. 50-80% sur la réticulation.

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TT est un conseiller cofondateur et scientifique à Alnylam Pharmaceuticals et un conseiller de Regulus Therapeutics.

Tampons et réactifs La croissance moyenne des cellules HEK293 <ul><li> DMEM </li><li> 10% de FBS </li><li> 2 mM de L-Glutamine </li><li> 100 U / ml de pénicilline </li><li> 100 U / ml de streptomycine </li><li> 100 pg / ml d&#39;hygromycine </li><li> 15 pg / ml blasticidine </li></ul> Solution stock 4-thiouridine (1 M) <ul><li> 260,27 mg de 4-thiouridine </li><li> 1 ml de DMSO </li></ul> Doxycycline stock (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg doxycycline </li><li> 1 ml de DMSO </li></ul> 1x tampon de lyse NP40 Préparer un stock de tampon 5x sans DTT et les inhibiteurs de protéase. Ajouter la TNT et inhibiteur de la protéase directement avant l&#39;expérience. <ul><li> HEPES 50 mM, pH 7,5 </li><li> 150 mM de KCl </li><li> 2 mM d&#39;EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM de DTT </li><li> complète l&#39;EDTA-libres cocktail inhibiteur de protéase (Roche) </li></ul> Tampon citrate-phosphate <ul><li> 4,7 g / l d&#39;acide citrique </li><li> 9,2 g / l de Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5,0 </li></ul> IP-tampon de lavage <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 300 mM de KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM de DTT (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li><li> complète l&#39;EDTA-libres cocktail inhibiteur de protéase (Roche) (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li></ul> Tampon de lavage haute-sel <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 500 mM de KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM de DTT (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li><li> complète l&#39;EDTA-libres cocktail inhibiteur de protéase (Roche) (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li></ul> La déphosphorylation de tampon <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 </li><li> 100 mM de NaCl </li><li> MgCl2 10 mM </li><li> DTT 1 mM </li></ul> Tampon de lavage Phosphatase <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 20 mM d&#39;EGTA </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li></ul> Polynucléotide kinase (PNK) tampon sans TNT <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> NaCl 50 mM </li><li> MgCl2 10 mM </li></ul> PNK tampon <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> NaCl 50 mM </li><li> MgCl2 10 mM </li><li> DTT 5 mM </li></ul> Tampon SDS Chargement de la page <ul><li> Glycérol à 10% (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 </li><li> 2 mM d&#39;EDTA </li><li> 2% (p / v) SDS </li><li> 100 mM de DTT </li><li> 0,1% de bleu de bromophénol </li></ul> 2x protéinase K tampons <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 150 mM de NaCl </li><li> 12,5 mM EDTA </li><li> 2% (p / v) SDS </li></ul>

par-clip - a method to identify transcriptome-wide the binding sites of rna binding proteins

Transcrits d&#39;ARN sont soumis à la régulation des gènes post-transcriptionnel en interagissant avec des centaines de protéines liant l&#39;ARN (pratiques commerciales restrictives) et microARN complexes contenant ribonucléoprotéine (miRNPs) qui sont souvent exprimés dans une cellule de type dépendante. Pour comprendre comment l&#39;interaction de ces facteurs liant l&#39;ARN affecte la régulation de la transcription individuels, des cartes à haute résolution in vivo des protéines-ARN interactions sont nécessaires 1. Une combinaison de facteurs génétiques, des approches biochimiques et informatiques sont généralement appliqués pour identifier l&#39;ARN-RBP ou de l&#39;ARN-RNP interactions. Profilage biopuces de l&#39;ARN associés aux pratiques commerciales restrictives immunopurifié (RIP-Chip) 2 définit les objectifs à un niveau du transcriptome, mais son application est limitée à la caractérisation des interactions cinétiquement stable et seulement dans de rares cas 3,4 permet d&#39;identifier l&#39;élément de reconnaissance RBP (RRE ) dans l&#39;ARN cible de long. Plus directe informations sur le site RBP cible est obtenu en combinant dans réticulation UV vivo 5,6 avec l&#39;immunoprécipitation 7-9 suivie de l&#39;isolement de segments d&#39;ARN réticulé et séquençage d&#39;ADNc (CLIP) 10. CLIP a été utilisé pour identifier les cibles d&#39;un certain nombre de pratiques commerciales restrictives 11-17. Toutefois, CLIP est limitée par la faible efficacité des UV à 254 nm ARN-protéine de réticulation, et l&#39;emplacement de la réticulation n&#39;est pas facilement identifiable au sein de l&#39;fragments séquencés réticulés, ce qui rend difficile de séparer les UV réticulé cibler des segments d&#39;ARN à partir de fond non réticulé fragments d&#39;ARN également présent dans l&#39;échantillon. Nous avons développé une approche puissante de réticulation basé sur des cellules de déterminer à haute résolution et du transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des pratiques commerciales restrictives cellulaire et miRNPs que nous appelons PAR-Clip (photoactivables-ribonucléoside-Enhanced réticulation et immunoprécipitation) (voir Fig. 1A pour un aperçu de la méthode). La méthode repose sur l&#39;incorporation d&#39;analogues ribonucléoside photoréactif, tels que le 4-thiouridine (4-SU) et 6-thioguanosine (6-SG) dans transcrits d&#39;ARN naissantes par des cellules vivantes. L&#39;irradiation des cellules par la lumière UV de 365 nm induit réticulation efficace de photoréactif nucléoside marqué ARN cellulaires aux pratiques commerciales restrictives qui interagissent. Immunoprécipitation de la RBP de l&#39;intérêt est suivie de l&#39;isolement de l&#39;ARN réticulé et coimmunoprecipitated. L&#39;ARN isolé est transformée en une banque d&#39;ADNc et profonde séquencé en utilisant la technologie Solexa. Un trait caractéristique de banques d&#39;ADNc préparées par RAP-Clip est que la position précise de réticulation peuvent être identifiés par des mutations qui résident dans l&#39;ADNc séquencés. Lorsque vous utilisez 4-SU, séquences réticulés thymidine à la transition cytidine, tandis que l&#39;aide de 6-SG résultats dans la guanosine à l&#39;adénosine mutations. La présence des mutations dans les séquences réticulé permet de les séparer du fond de séquences dérivées d&#39;ARN cellulaires abondants. Application de la méthode à un certain nombre de protéines liant l&#39;ARN diversifié a été signalé dans Hafner et al. 18

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PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

Transcrits d&#39;ARN sont soumis à régulation post-transcriptionnelle vaste qui est médiée par une multitude d&#39;action trans protéines liant l&#39;ARN (pratiques commerciales restrictives). Nous présentons ici une méthode généralisable pour identifier précisément et à l&#39;échelle du transcriptome à l&#39;échelle des sites liaison à l&#39;ARN de pratiques commerciales restrictives.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

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53.2K vues.  Rockefeller University. Transcrits d'ARN sont soumis à régulation post-transcriptionnelle vaste qui est médiée par une multitude d'action trans protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives). Nous présentons ici une méthode généralisable pour identifier précisément et à l'échelle du transcriptome à l'échelle des sites liaison à l'ARN de pratiques commerciales restrictives.