Les auteurs remercient tous les membres des laboratoires de Ule, Luscombe et Zupan de discussion et d&#39;assistance expérimentale. Nous remercions James Hadfield et Nik Matthews pour séquençage à haut débit. Nous tenons à souligner que la méthode décrite ici iClip part plusieurs étapes avec le protocole clip original, développé par Kirk Jensen et JU dans le laboratoire de Robert Darnell. Ce travail a été soutenu par la subvention européenne du Conseil de recherches 206726-CLIP à JU et une longue durée bourse Human Frontiers Science Program à JK

1. UV réticulation des cellules de culture tissulaire <ol><li> Retirez le papier et ajouter 6 ml PBS glacé aux cellules cultivées dans une plaque de 10 cm (pour trois expériences). </li><li> Retirer le couvercle et placer sur la glace. Irradier une fois avec 150 mJ / cm 2 à 254 nm. </li><li> Récolter les cellules en grattant avec un lifter cellule. </li><li> Transfert 2 ml de suspension cellulaire à chacun des trois microtubes. Spin à toute vitesse pendant 10 secondes à 4 ° C pour sédimenter les cellules, puis retirer le surnageant. </li><li> Snap-geler les culots cellulaires sur la glace sèche et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. La préparation de billes <ol><li> Ajouter 100 ul de la protéine A Dynabeads (Dynal, 100,02) par expérience pour un microtube frais (Utilisez la protéine G Dynabeads pour une souris ou d&#39;anticorps de chèvre). </li><li> Lavez perles 2x avec un tampon de lyse (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; désoxycholate de sodium à 0,5%; 1 / 100 inhibiteur de protéase cocktail III, Calbiochem). </li><li> Remettre les billes dans 100 ul de tampon de lyse avec 2-10 anticorps ug. </li><li> Rotation des tubes à température ambiante pendant 30-60 min. </li><li> Laver 3x avec 900 ul de tampon de lyse et laisser dans le dernier lavage avant d&#39;être prêt à passer à l&#39;étape 4.1. </li></ol> 3. Lyse cellulaire et digestion partielle ARN <ol><li> Reprendre le culot cellulaire dans du tampon de lyse 1 ml et transférer à microtubes de 1,5 ml. </li><li> Préparer une dilution 1 / 500 de la RNase I (Ambion, AM2295). Ajouter 10 ul RNase I dilution ainsi que 2 pl Turbo DNase au lysat cellulaire (1 / 500 RNase dilutions I [faible RNase] sont utilisées pour la préparation de la bibliothèque; 1 / 50 dilutions [haute RNase] sont nécessaires pour contrôler la spécificité des anticorps) . </li><li> Incuber les échantillons pendant exactement 3 minutes à 37 ° C, en agitant à 1100 rpm. Immédiatement transfert à glace. </li><li> Centrifuger à 4 ° C et 22 000 g pendant 20 min pour effacer le lysat. Recueillir soigneusement le surnageant (laisser environ 50 ul de lysat avec le culot). </li></ol> 4. Immunoprécipitation <ol><li> Retirez le tampon de lavage des billes (de l&#39;étape 2.5), puis ajouter le lysat cellulaire (de l&#39;étape 3.4). </li><li> Tournez les échantillons pendant 2 h à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant et laver les billes de 2x avec 900 pi de haut-sel tampon (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% de désoxycholate). </li><li> Laver 2x avec 900 ul de tampon de lavage (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% de Tween-20). </li></ol> 5. La déphosphorylation des extrémités 3 &#39;ARN <ol><li> Jeter le surnageant et remettre les billes en 20 PNK mélangez ul (15 ul d&#39;eau; 4 pl pH 6,5 5x PNK buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul enzyme PNK; 0,5 ul RNasine [Promega]). </li><li> Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon de lavage et laver 1x avec forte teneur en sel tampon. </li><li> Laver 2x avec un tampon de lavage. </li></ol> 6. Ligature Linker à l&#39;ARN extrémités 3 &#39; <ol><li> Retirez délicatement le surnageant et remettre les billes en 20 mélange de ligature ul (9 ul d&#39;eau, 4 pi de tampon ligature 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 mM de dithiothréitol]; 1 pl ARN ligase [ONE]; 0,5 RNasine ul [Promega]; 1,5 ul pré-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 pl PEG400 [81170, Sigma]). </li><li> Incuber une nuit à 16 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon de lavage, puis lavez 2x avec 1 ml de haute sel tampon. </li><li> Laver 2x avec 1 ml de tampon de lavage et laisser dans 1 ml de la deuxième lavage. </li></ol> 7. Étiquetage fin ARN 5 &#39; <ol><li> Retirer le surnageant et remettre les billes en 8 ul du PNK mélange à chaud (0,4 pi PNK [ONE]; 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul de tampon 10x PNK [ONE]; eau 6 pi). </li><li> Incuber pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer le mélange PNK chaud et remettre en suspension les perles dans 20 tampon 1x chargement ul NuPAGE (Invitrogen). </li><li> Incuber sur un thermomixer à 70 ° C pendant 10 min. </li><li> Immédiatement placer sur un aimant pour précipiter les perles vide et charger le surnageant sur le gel (voir étape 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE et transfert sur membrane <ol><li> Charger les échantillons sur un NuPAGE 4-12% de Bis-Tris gel (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Utiliser 0,5 L de 1x MOPS courir tampon (Invitrogen). Également charger 5 pi d&#39;un marqueur pré-teint protéine de taille (par exemple la règle PAGE plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Exécutez le gel pendant 50 min à 180 V. </li><li> Retirer le gel de l&#39;avant et jeter les déchets solides (contient gratuitement ATP radioactif). </li><li> Transfert des complexes protéines-ARN à partir du gel d&#39;une membrane de nitrocellulose en utilisant l&#39;appareil de transfert Novex humide selon les instructions du fabricant (Invitrogen, transférer 1 h à 30 V). </li><li> Après le transfert, rincer la membrane dans du tampon PBS, puis l&#39;envelopper dans du Saran Wrap et de l&#39;exposer à un film Fuji à -80 ° C (placer un autocollant fluorescent à côté de la membrane pour l&#39;aligner tqu&#39;il film et la membrane; effectuer des expositions pendant 30 min, 1h et plus la nuit). </li></ol> 9. Isolement de l&#39;ARN <ol><li> Isoler les complexes protéines-ARN à partir de l&#39;expérience à faible RNase en utilisant l&#39;autoradiographie de l&#39;étape 8.5 comme un masque. Couper ce morceau de membrane en plusieurs petites tranches et les placer dans un microtube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM d&#39;EDTA) et 10 pl protéinase K (Roche, 03115828001) pour les morceaux de membrane. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 200 pl de tampon PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM EDTA, 7 M d&#39;urée) et incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Recueillir la solution et l&#39;ajouter avec 400 pi de phénol / chloroforme (Ambion, 9722) à une phase 2 ml de gel de verrouillage du tube lourd (713 à 2536, VWR) ARN. </li><li> Incuber pendant 5 min à 30 ° C, en agitant à 1100 rpm. Séparer les phases en faisant tourner pendant 5 min à 13000 rpm à température ambiante. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube (attention à ne pas toucher le gel avec la pipette). Ajouter 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) et 40 pi 3 M pH acétate de sodium 5,5 et mélanger. Puis ajoutez 1 ml d&#39;éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 10. La transcription inverse <ol><li> Spin pendant 20 min à 15000 rpm et 4 ° C. Enlever le surnageant et laver le culot avec 0,5 ml d&#39;éthanol à 80%. </li><li> Reprendre le culot dans 7,25 ARN ul / mélange d&#39;amorces (6,25 pi d&#39;eau, 0,5 apprêt Rclip ul [0.5pmol/μl]; 0,5 ul de dNTP mix [10 mm]). Pour chaque expérience ou de reproduire, utiliser un apprêt Rclip différents contenant des séquences de codes à barres individuel (voir 14). </li><li> Incuber pendant 5 min à 70 ° C avant de refroidir à 25 ° C. </li><li> Ajouter 2,75 ul RT mélange (2 ul de tampon 5x RT; 0,5 ul DTT 0,1 M; 0,25 ul Exposant III de la transcriptase inverse [Invitrogen]). </li><li> Incuber 5 min à 25 ° C, 20 min à 42 ° C, 40 min à 50 ° C et 5 min à 80 ° C avant de refroidir à 4 ° C. </li><li> Ajouter 90 ul de tampon TE, 0,5 glycoblue ul et 10 ul d&#39;acétate de sodium pH 5,5 et mélanger. Puis ajouter 250 ul d&#39;éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 11. Purification sur gel d&#39;ADNc <ol><li> Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans 6 pl d&#39;eau. </li><li> Ajouter 6 ul de tampon de chargement 2x TBE-urée (Invitrogen). Échantillons de chaleur à 80 ° C pendant 3 min avant de le charger directement. </li><li> Charger les échantillons sur un préfabriqué 6% TBE-urée gel (Invitrogen) et courir pendant 40 min à 180 V comme décrit par le fabricant. Également charger un marqueur de faible poids moléculaire pour le découpage ultérieur (voir ci-dessous). </li><li> Couper trois bandes à 120-200 NT (élevé), de 85 à 120 nt (moyen) et 70 à 85 nt (basse). Utilisez theupper colorant et les marques sur le support de gel de plastique afin de guider l&#39;excision (voir Figure 3). Notez que l&#39;amorce et la séquence Rclip L3 représentent ensemble 52 nt de la séquence de CLIP. </li><li> Ajouter 400 ul de TE et écraser la tranche de gel en petits morceaux à l&#39;aide d&#39;un piston de seringue 1 ml. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 2 h à 37 ° C. </li><li> Placer deux de 1 cm de verre pré-filtres (Whatman, 1.823.010) dans une colonne Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Transfert de la partie liquide de l&#39;échantillon à la colonne. Spin pendant 1 min à 13000 rpm dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 0,5 glycoblue ul et 40 ul d&#39;acétate de sodium pH 5,5, puis mélanger l&#39;échantillon. Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 12. Ligature d&#39;apprêt à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ADNc <ol><li> Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans huit mélange de ligature ul (6,5 ul d&#39;eau, 0,8 ul de tampon 10x CircLigase II; 0,4 pi 50 mM MnCl2; 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) et incuber pendant 1 h à 60 ° C. </li><li> Ajouter 30 ul mélange d&#39;oligo recuit (26 ul d&#39;eau, 3 tampons FastDigest ul [Fermentas]; 1 pl cut_oligo [10 pM]). Incuber 1 min à 95 ° C. Puis baisser la température toutes les 20 sec de 1 ° C jusqu&#39;à 25 ° C sont atteints. </li><li> Ajouter 2 ul BamHI (Fast Fermentas) et incuber pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 50 ul de TE et 0,5 glycoblue ul et mélanger. Ajouter 10 ul d&#39;acétate de sodium pH 5,5 et mélanger, puis ajouter 250 ul d&#39;éthanol à 100%. Mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 13. L&#39;amplification par PCR <ol><li> Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remise en suspension le culot dans 19 ul d&#39;eau. </li><li> Préparer le mélange de PCR (19 ul d&#39;ADNc; 1 pl apprêt mélangez P5/P3 Solexa, 10 uM de chacun; 20 Accuprime ul Supermix une enzyme [Invitrogen]). </li><li> Exécutez le programme PCR suivant: 94 ° C pendant 2 min, [94 ° C pendant 15 sec, 65 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 30 sec] 25-35 cycles, 68 ° C pendant 3 min, 4 ° C pour toujours. </li><li> Mélanger 8 produit ul PCR avec 2 pi de tampon TBE chargement 5x et charge sur un gel de TBE préfabriqué 6% (InvitRogen). Tache le gel avec SybrGreen I (Invitrogen) et d&#39;analyser avec un imageur de gel. </li><li> Le code-barres dans les amorces Rclip permettent à des échantillons de différents multiplex avant de soumettre pour le séquençage à haut débit. Soumettez 15 ul de la bibliothèque pour le séquençage et de stocker le reste. </li></ol> 14. Des séquences de liaison et de l&#39;amorce ADN lieur Pré-adenylated 3 &#39;: [Nous commandons l&#39;adaptateur d&#39;ADN de IDT et ensuite faire des aliquotes de 20μM.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="L&#39;ADN" /> 15. Les résultats représentatifs: Avant de séquençage de la bibliothèque iClip, le succès de l&#39;expérience peuvent être surveillés à deux étapes: l&#39;autoradiographie du complexe protéine-ARN, après transfert sur membrane (étape 8.5) et l&#39;image du gel des produits de PCR (étape 13.4). Dans l&#39;autoradiographie des échantillons à faible RNase, la radioactivité diffuse doit être considéré au-dessus du poids moléculaire de la protéine (figure 2, l&#39;échantillon 4). Pour haute RNase échantillons, cette radioactivité est concentrée près de la masse moléculaire de la protéine (figure 2, l&#39;échantillon 3). Si aucun anticorps n&#39;est utilisé dans l&#39;immunoprécipitation, aucun signal doit être détecté (figure 2, les échantillons 1 et 2). D&#39;autres commandes importantes pour la spécificité de l&#39;immunoprécipitation omettez d&#39;irradiation UV ou les cellules utilisent qui n&#39;expriment pas la protéine d&#39;intérêt 14. L&#39;image du gel des produits de PCR (étape 13.4) devrait montrer une gamme de taille qui correspond à la fraction d&#39;ADNc (haute, moyenne ou faible) purifié à l&#39;étape 11.4 (Figure 4, voies 4-6). Notez que les amorces PCR P3Solexa et P5Solexa introduire un supplémentaire 76 nt à la taille de l&#39;ADNc. Si aucun anticorps n&#39;est utilisé pendant l&#39;immunoprécipitation, aucun produit correspondant PCR devrait être détectés (figure 4, pistes 1-3). Produit dimère Primer peut apparaître à environ 140 nt. Pour obtenir des résultats représentatifs de séquençage à haut débit et des analyses ultérieures bioinformatiques voir 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique du protocole de iClip. Protéines-ARN sont des complexes de liaisons croisées covalentes in vivo en utilisant l&#39;irradiation UV (étape 1). La protéine d&#39;intérêt est purifié avec l&#39;ARN lié (étapes 2-5). Afin de permettre une séquence-spécifique d&#39;amorçage de la transcription inverse, un adaptateur ARN est ligaturé à l&#39;extrémité 3 &#39;de l&#39;ARN, tandis que l&#39;extrémité 5&#39; est marquée radioactivement (étapes 6 et 7). Réticulé complexes protéine-ARN sont purifiés à partir d&#39;ARN gratuitement en utilisant SDS-PAGE et transfert sur membrane (étape 8). L&#39;ARN est récupéré à partir de la membrane en digérant les protéines à la protéinase K laissant un polypeptide restant à la réticulation de nucléotides (étape 9). La transcription inverse (RT) tronque le polypeptide restant et introduit deux régions adaptateur clivables et des séquences de codes à barres (étape 10). Sélection taille supprime sans apprêt RT avant circularisation. La linéarisation suivante génère des modèles appropriés pour l&#39;amplification par PCR (étapes 11-15). Enfin, séquençage à haut débit génère lit dans lequel les séquences de codes à barres sont immédiatement suivis par le dernier nucléotide de l&#39;ADNc (étape 16). Depuis ce nucléotide localise une position en amont du nucléotide réticulé, le site de liaison peut être déduite à haute résolution. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Autoradiographie d&#39;réticulé hnRNP C-ARN complexes en utilisant l&#39;électrophorèse sur gel dénaturant et transfert sur ​​membrane. hnRNP C-ARN étaient complexes immuno-purifié à partir d&#39;extraits cellulaires utilisant un anticorps contre hnRNP C (α hnRNP C, les échantillons 3 et 4). L&#39;ARN a été partiellement digéré avec faible (+) ou haute (+ +) concentration de RNase. Complexes déplacer vers le haut de la taille de la protéine (40 kDa) peuvent être observés (échantillon 4). Le décalage est moins prononcée lorsque de fortes concentrations de RNase ont été utilisés (échantillon 3). Le signal radioactif disparaît lorsque aucun anticorps a été utilisé dans l&#39;immunoprécipitation (échantillons 1 et 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Schéma 6% TBE-urée gel (Invitrogen) pour guider l&#39;excision des produits iClip ADNc. Le gel est géré pendant 40 min à 180 V conduisant à un modèle de migration reproductible des ADNc et des colorants (la lumière et bleu foncé) dans le gel. Utilisez une lame de rasoir pour couper (ligne rouge) du haut (H), moyenne (M), et faible (L) des fractions d&#39;ADNc. Commencez par couper au milieu du colorant bleu clair et immédiatement au-dessus de la marque sur la cassette de gel en plastique. Diviser les fractions moyennes et basses et les garnitures de la fraction haute d&#39;environ 1 cm au-dessus du colorant bleu clair. Utilisez des coupes verticales guidé par les poches et le colorant de séparer les différentes voies (dans cet exemple 1-4). La voie de marqueur (m) peut être teinté et imagé pour contrôlertailles après la coupe. Fragment tailles sont indiquées sur la droite. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Analyse des bibliothèques iClip amplifiée par PCR d&#39;ADNc en utilisant l&#39;électrophorèse sur gel. L&#39;ARN récupéré de la membrane (figure 1) était une transcription inverse et la taille purifié par électrophorèse sur gel dénaturant (figure 2). Trois fractions granulométriques de l&#39;ADNc (haute [H]: 120-200 NT, moyenne [M]: 85-120 nt et basse [L]: 70-85 nt) ont été récupérés, circularisé, re-linéarisé et amplifiée par PCR. Les produits de PCR de la distribution de tailles différentes peuvent être observées en raison des différentes tailles des fractions d&#39;entrée. Depuis l&#39;amorce de PCR introduit 76 nt à l&#39;ADNc, tailles devrait se situer entre 196 à 276 nt pour élevée, de 161 à 196 nt pour les moyennes et 146-161 nt pour des fractions de faible taille. Les produits de PCR sont absents lorsque aucun anticorps a été utilisé pour l&#39;immunoprécipitation (pistes 1-3).

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Depuis le protocole de iClip contient un large éventail de réactions enzymatiques et des étapes de purification, il n&#39;est pas toujours facile d&#39;identifier un problème quand une expérience échoue. Afin de contrôler la spécificité de l&#39;ARN identifiés réticuler des sites, un ou plusieurs contrôles négatifs doivent être maintenues tout au long de l&#39;expérience complète et des analyses ultérieures de calcul. Ces contrôles peuvent être l&#39;échantillon ne-anticorps, les cellules non-réticulés, ou immunoprécipitation à partir de cellules ou de tissus KO. Idéalement, ces expériences de contrôle ne doit pas purifier tout complexes protéines-ARN, et ne devrait donc pas émettre de signal sur le gel SDS-PAGE, et aucun produit détectable après amplification par PCR. Séquençage à haut débit de ces bibliothèques de contrôle devrait revenir très peu de séquences uniques. Knockdown cellules ne sont pas recommandés comme un contrôle séquençage, puisque les séquences résultantes correspondent toujours à liaison croisée des sites de la même protéine, qui est purifiée à partir de cellules knockdown en plus petites quantités. Des précautions doivent également être prises pour éviter toute contamination avec les produits de PCR à partir d&#39;expériences antérieures. La meilleure façon de minimiser ce problème est de séparer spatialement les étapes pré-et post-PCR. Idéalement, l&#39;analyse des produits de PCR et de toutes les mesures ultérieures doivent être effectuées dans une pièce séparée. Par ailleurs, chaque membre du laboratoire devrait utiliser son propre ensemble de tampons et d&#39;autres réactifs. De cette façon, les sources de contamination peuvent être facilement identifiés.

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Pour électrophorèse sur gel et transfert sur membrane, nous recommandons l&#39;utilisation de t-il XCell SureLock ® Mini-Cell et XCell II ™ Blot Module Kit Marque CE (Invitrogen, EI0002), qui est compatible avec l&#39;utilisation de la minigels préfabriqué différents qui sont spécifiés dans le protocole de . Le nombre de marques et de l&#39;ordre de tous les matériaux utilisés est mentionné au cours du protocole. La liste des enzymes utilisées dans le protocole est indiqué dans le tableau ci-dessous. <table border="1"><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Protéine A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> l&#39;utilisation de protéine G pour les anticorps de souris ou de chèvre </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> l&#39;activité peut changer d&#39;un lot à </td></tr><tr><td> T4 ARN ligase I </td><td> ONE </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> ONE </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> protéinase K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Exposant III de la transcriptase inverse </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> ce mélange de PCR donne les meilleurs résultats dans nos mains </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

La composition unique et la disposition spatiale des protéines liant l&#39;ARN (pratiques commerciales restrictives) sur une transcription guider les divers aspects de la régulation post-transcriptionnelle 1. Par conséquent, une étape essentielle vers la compréhension règlement transcription au niveau moléculaire est d&#39;obtenir des informations de position sur les sites de liaison des pratiques commerciales restrictives 2. Interactions protéines-ARN peut être étudiée par des méthodes biochimiques, mais ces approches ne tiennent pas compte liaison à l&#39;ARN dans son contexte cellulaire native. Les premières tentatives pour étudier des protéines-ARN complexes dans leur environnement cellulaire employée purification par affinité ou immunoprécipitation combinée avec l&#39;affichage différentiel ou de l&#39;analyse des microréseaux (RIP-CHIP) 3-5. Ces approches ont été enclins à identifier les interactions indirectes ou non physiologiques 6. Afin d&#39;accroître la spécificité et la résolution de position, une stratégie appelée CLIP (UV réticulation et immunoprécipitation) a été introduit 7,8. CLIP combine réticulation UV des protéines et des molécules d&#39;ARN avec des schémas de purification rigoureux, y compris l&#39;électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant. En combinaison avec les technologies de séquençage à haut débit, CLIP a prouvé qu&#39;il était un outil puissant pour étudier les interactions protéines-ARN à l&#39;échelle du génome entier (dénommé HITS-CLIP ou CLIP-seq) 9,10. Récemment, PAR-CLIP a été introduit qui utilise des analogues ribonucléoside photoréactif pour la réticulation 11,12. Malgré la grande spécificité des données obtenues, des expériences CLIP génèrent souvent des banques d&#39;ADNc de la complexité de séquence limitée. Ceci est partiellement dû à la quantité limitée de co-ARN purifié et les deux inefficaces réactions de ligature ARN nécessaires à la préparation de la bibliothèque. En outre, les analyses d&#39;extension d&#39;amorces ont indiqué que de nombreux ADNc tronquent prématurément à l&#39;réticulé 13 nucléotides. Ces ADNc tronqués sont perdus pendant le protocole de préparation CLIP bibliothèque standard. Nous avons récemment développé iClip (CLIP résolution individuelle de nucléotides), qui capte l&#39;ADNc tronqués en remplaçant l&#39;une des étapes intermoléculaires inefficaces ligature d&#39;ARN avec une circularisation plus efficace ADNc intramoléculaire (figure 1) 14. Surtout, le séquençage des ADNc tronqués fournit un aperçu de la position du site de liaison croisée avec une résolution de nucléotides. Nous appliquée avec succès pour étudier l&#39;organisation iClip hnRNP particules C sur une échelle du génome entier et d&#39;évaluer son rôle dans la régulation 14 d&#39;épissage.

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iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

L&#39;arrangement spatial des protéines liant l&#39;ARN sur une transcription est un déterminant clé de la régulation post-transcriptionnelle. Par conséquent, nous avons développé différents nucléotides réticulation UV résolution et immunoprécipitation (iClip) qui permet précisément l&#39;échelle du génome de cartographie des sites de liaison d&#39;une protéine liant l&#39;ARN.

iClip - transcriptome à l&#39;échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

Research

JoVE Journal

Biology

58.1K vues.  Medical Research Council - MRC. L'arrangement spatial des protéines liant l'ARN sur une transcription est un déterminant clé de la régulation post-transcriptionnelle. Par conséquent, nous avons développé différents nucléotides réticulation UV résolution et immunoprécipitation (iClip) qui permet précisément l'échelle du génome de cartographie des sites de liaison d'une protéine liant l'ARN.

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Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Non-invasive visualisation 3D avec résolution submicronique utilisant synchrotron à rayons X-tomographie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Recherche

Biologie

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

La libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Analyse de l&#39;interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Cartographie des séquelles de Theta Burst Stimulation sur le cortex auditif humain à l&#39;imagerie fonctionnelle

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

La cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: L&#39;échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.