我々は有用な議論のためTuschl研究室のメンバーに感謝。 MHは、ドイツ学術交流会（DAAD）によってサポートされています。この作品は、スイス国立基金助成MZへ＃3100A0 - 114001によってサポートされていました; TTは、HHMIの研究者でもある、と彼の研究室での作業は、NIHの助成金GM073047とMH08442とスター財団によってサポートされていました。

以下のプロトコルは、FLAG /ドキシサイクリンによる誘導時にHAタグIGF2BP1を発現するHEK293細胞に対するPAR -クリップの手順を説明します。我々は、免疫沈降のために抗FLAG抗体を使用します。 免疫沈降のための効率的な抗体が利用できる場合は、PAR -クリップは、内因性の検出可能なレベルを表す任意のセルラインで動作する、興味のRNA結合タンパク質（RBP）をタグなし。 拡大するセル<ol><li>増殖培地中でFlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1セルを展開します。我々は出発点として100〜400 × 10 6個の細胞（約10〜40 15cmの細胞培養プレート）の間に使用することをお勧めします。約80％コンフルエントにそれらを成長する。 </li><li>架橋前の14時間は、直接細胞培養培地に100μMの最終濃度（1 M 4 -チオウリジン原液の1:1000 V / V）に）4 -チオウリジンを追加し、b）の FLAG / HAの発現を誘導するドキシサイクリン（10 mg / mlのドキシサイクリンの原液の1:10,000 V / V）の1μg/ mlの添加によりIGF2BP1をタグ付け。注：代わりに、6 - チオグアノシン100μMを使用することができます4チオウリジンの。 </li></ol> UVクロスリンク<ol><li>プレートあたり10 mlの氷冷したPBSで細胞を1回洗浄し、完全にPBSを取り除く。 </li><li> Stratalinker 2400（ストラタジーン社製）または同様の装置は0.15 J / cm 2で 365nmの紫外光で発見された氷と照射するとトレイの上に置きますがプレート。 </li><li> 50 mlの遠心チューブにプレート、転送ごとに1 mlのPBSでラバーポリスマンで細胞をこすり落とすと4℃で5分間、500 × gで遠心分離によって収集し、上清を捨てる。 100 × 10 6 HEK293細胞は、（10 15 cmのプレート）約が得られます。ウェット細胞ペレットを1ml。 </li><li> （オプション）を使用すると、細胞溶解と直接続行する場合を除き、衝撃は-80℃で液体窒素とストア内の細胞ペレットを凍結℃に細胞ペレットは、少なくとも12ヶ月間保存することができます。 </li></ol>細胞溶解とRNaseT1ダイジェスト<ol><li> 1X NP40溶解バッファーの3倍量の架橋の細胞の細胞ペレットを取るし、10分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 4℃で15分間、13,000 × gで遠心分離により透明な細胞ライセート℃の</li><li> 0.2μmのメンブレンシリンジフィルター（ポールアクロディスクまたは同等品）を介して濾過することによって、さらにライセートをクリアします。 </li><li> 22℃15分間水浴中で1 U /μlとインキュベートの最終濃度にRNase T1を（Fermentas、10,000 U /μl）を添加℃に次に進む前に、氷上で5分間、その後涼しい反応。 </li></ol>免疫沈降と架橋標的RNA断片の回収磁気分離装置を使用する乾燥から磁気ビーズを防ぐために試料調製を通じて、以下のガイドラインに従ってください。 <ol><li> 1 2分間マグネチックスタンドでビーズを含むチューブを置きます。 </li><li>チューブは、マグネット分離装置にある間チューブにバッファを追加します。 </li><li>チューブにキャップを、磁気分離装置から削除し、そしてビーズを懸濁します。あなたの指でチューブをフリックでビーズを再懸濁したり、5に設定したボルテックスを使用することができます。 </li><li>チューブのキャップに残っている可能性のあるビーズを収集するためにスピンダウンする。 </li><li>必要に応じて繰り返し、手順1〜4を繰り返します。 </li></ol>磁性ビーズの調製<ol><li> 1.5mlマイクロチューブにダイナプロテインG磁性粒子（Invitrogen社製）1ml当たり細胞ライセート（それは約あるべき典型的な実験のため。ビーズの40 50μL）の10μlを移してください。クエン酸 - リン酸緩衝液1mlで二回ビーズを洗浄してください。 </li><li>ビーズ懸濁液を元のボリュームに対する相対的なクエン酸 - リン酸緩衝液の倍のボリュームに再懸濁します。 </li><li>抗FLAG M2モノクローナル抗体（Sigma社製）1ml当たり、室温で40分間回転する車輪のサスペンションとインキュベート0.25μgのを追加。 </li><li>未結合抗体を除去するクエン酸 - リン酸緩衝液1mlに二回ビーズを洗浄する。 </li><li>ビーズ懸濁液を元のボリュームに対する相対的なクエン酸 - リン酸緩衝液の二倍量でビーズを再懸濁します。 </li></ol>免疫沈降（IP）、第二のRNase T1の消化、および脱リン酸化<ol><li>部分的なリボヌクレアーゼT1処理した細胞溶解液のmlあたり、新たに調製した抗体結合磁性ビーズ20μlを追加し、4℃で1時間回転するホイール​​に15 mlの遠心チューブでインキュベート℃の</li><li> 15と50 ml遠心チューブ（Invitrogen社）のために磁性粒子コレクタに磁気ビーズを収集し、1.5mlマイクロチューブに移す。 </li><li> IP洗浄緩衝液1ml中にビーズを3回洗浄する。 </li><li> 100 U /μlの最終濃度にRNaseT1を（Fermentas、10,000 U /μl）を添加し、22℃15分間水浴中でビーズ懸濁液をインキュベート℃に氷の上に続いてクール5分間。 </li><li>高塩分洗浄緩衝液1ml中にビーズを3回洗浄する。 </li><li>脱リン酸化緩衝液の1ボリュームでビーズを再懸濁し</li><li> 0.5 U /μlの最終濃度にウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP、NEB）を追加し、37℃で10分間懸濁液をインキュベート℃に</li><li>ホスファターゼの洗浄緩衝液1mlに二回ビーズを洗浄</li><li> DTTのないポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）バッファー（酵素反応に必要なDTT濃度は、磁気ビーズを傷つけないように十分な高さ）で二回ビーズを洗浄する。 </li><li> PNKバッファの1つのオリジナルビーズのボリュームでビーズを再懸濁し</li></ol>免疫沈降したタンパク質に架橋したRNAセグメントの放射性標識<ol><li>ビーズ懸濁液は、上記に一つのオリジナルビーズのボリュームで1 U /μlに0.5μCiの/μlおよびT4 PNK（NEB）の最終濃度にΥ- 32 P - ATPを加える。 37℃で30分間懸濁液をインキュベート℃に</li><li> 100μMの最終濃度を取得し、37℃でさらに5分間インキュベートする非放射性ATPを追加℃に</li><li> DTTなしPNKバッファー800μLと磁気ビーズを5回洗浄する。 </li><li> SDS - PAGEローディングバッファー70μlでビーズを再懸濁します。 </li></ol>ゲルスライスからSDS - PAGEおよび架橋RNA -タンパク質複合体の電気溶出<ol><li> 95℃のヒートブロックで5分間放射性標識、懸濁液をインキュベート° C変性させ、架橋RNAと渦との免疫沈降RBPを解放する。 </li><li>セパレータ上に磁気ビーズを外し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移す。 </li><li> 40の上清をウェルあたりのNOVEXビス - トリス4から12パーセント（Invitrogen社）のプレキャストポリアクリルアミドゲルをロードし、200で55分間ゲルを実行V. </li><li>ゲルのチャンバーを分解し、それがワンプレートに取り付けられたまま、ゲルを解体。 phosphorimagerのプリントアウトにゲルの配置を容易にするために、我々は、ゲルの四隅の三時に非対称的つの小さな放射性ゲル片を移植することをお勧めします。放射性ゲル片は、以前は放射性標識合成オリゴヌクレオチドを​​精製するために使用されたゲルから回収することができる。汚染を避けるために、プラスチックフィルム（例：サランラップ）でゲルをラップします。 </li><li> 1時間のブランクphosphorimager画面にゲルを公開し、phosphorimagerに視覚化する。 </li><li>向きを移植されたゲル片を使用してphosphorimagerのプリントアウトの上にゲルを合わせます。 RBPの予想サイズ（IGF2BP1、約75kDaの）に対応するバンドを切り出し、D -チューブダイアライザーミディチューブに移すと800μlの1 × SDS泳動バッファーを加える。 </li><li> 2時間、100Vで1 × SDSランニングバッファーで架橋したRNA - RBP複合体をElectroeluteゲルから切り出し、製造業者の指示にしたがって800μlのSDSランニングバッファーでD -チューブダイアライザーミディ（Novagen社）にelectroeluted。 </li></ol>プロテイナーゼK消化<ol><li>は1.2 mg / mlの最終濃度にプロテイナーゼK（ロシュ）を加えて、electroeluateを基準にして2倍のプロテイナーゼK等量のバッファーを追加。 55℃で30分間インキュベートする</li><li>酸性フェノール/クロロホルム/ IAA抽出（25:24:1、pH4.0）をクロロホルム抽出が続くことによりRNAを回復する。グリコーゲンを1μl（10 mg / mlストック）を追加するには、エタノールの3倍量を添加することによりRNAを沈殿させる。 10.5μlの水でペレットを溶解する。 </li></ol> cDNAライブラリーの準備と深いシーケンシングもともと小さな規制RNAを19のクローニングのために説明した標準的なcDNAライブラリーの準備のプロトコルを介して回収したRNAを運ぶ。回収されたRNAの10.5μlを用いて20μlのスケールで説明したように、最初のステップ、3&#39;アダプターのライゲーションは、実施した。 Solexaシーケンシングアダプター説明した設定を使用してください。回収されたRNAの量に応じて、挿入せずに5&#39; -アダプタ- 3&#39; -アダプター製品は、追加のPCRのバンドのようなcDNAの増幅後に検出されることがあります。このようなケースでは、消費税3％NuSieveから予想されたサイズの長いPCR産物は、低融点アガロースゲル、Solexaの技術を使用してGelEluteキット（キアゲン）とシーケンスを使用してゲル片からのPCR産物を溶出させる。 One Solexaシーケンシングの実行は通常、6と1000万シーケンスの間にaffords RNA結合タンパク質の結合部位のトランスクリプトームを幅広くカバーするために十分であることを読み取ります。 バイオインフォマティクスの解析シーケンスの慎重なバイオインフォマティクス解析には、RBPが持つようなRNAの認識の要素として検討RBPのRNA結合部位、に有意義な洞察を得るために行われるニーズ、優先結合領域を読み込み（エクソン対イントロン、順序対非翻訳をコーディングシーケンス）。読み出しシーケンスは、ゲノムやESTデータベースに対して整列する必要があります。我々は通常、読み取りmappiを使用してくださいまで1つのミスマッチにあるユニークなゲノムのngは、シーケンスのクラスタを構築するために挿入または欠失は、さらに分析することができます読み込みます。 6 - SGを使用して遷移する4 - SUおよびGを使用するときにクラスタ化されたシーケンスの特性変異の頻度は、Cの遷移に、Tを読み込み、正常に架橋シーケンスを示すものである。我々の経験では4 - SUで標識した未架橋のRNAは、約20％のバックグラウンドの突然変異率を示しています。この率は約に増加しています。架橋時に50から80パーセント。 バイオインフォマティクス解析の詳細な説明は、ハーフナーらによって出版物の補足材料で見つけることができます。18 オプションの手順トータルRNAへの4 - チオウリジンの取り込みレベルの決定安定的に収穫前に100μM4SU 16時間を添加した培地で生育した後、興味のRBPを発現する細胞株から全RNAを分離する。コントロールとして、収穫の細胞は4SU添加することなく成長して。製造業者の指示に従って洗浄細胞ペレットにTrizol試薬（シグマ）の3倍量を添加することによりトータルRNAを分離します。さらに、製造業者のプロトコールに従ってキアゲンしたRNeasyを使用してトータルRNAを精製した。 RNAの単離と解析中に4SUの酸化を防止するために、洗浄バッファーとその後の酵素のステップに0.1 mMジチオスレイトール（DTT）を追加します。ダイジェストとHPLC分析のための単一のヌクレオシドに脱リン酸化されたトータルRNAは、20日までに説明した。簡単に言うと、30μlの体積で、37℃で16時間トータルRNAを精製したの40μgをしたインキュベートします0.4 U細菌アルカリホスファターゼ（生化学ワーシントン）および0.09 Uのヘビの毒を持つCホスホジエステラーゼ（ワーシントン生化学）。参照標準として、合成4SU標識RNA、（我々は標準的にCGUACGCGGAAUACUUCGA（4SU）Uを使用）し、また、酵素消化を完了するために件名を使用する。スペルコディスカバリーC18（結合相のシリカ5μm粒子、250 × 4.6 mm）の逆相カラム（ベルフォンテ、ペンシルバニア、米国）のHPLCによるリボヌクレオシドの結果として得られる混合物を分離します。 HPLCのバッファは3％アセトニトリル（）と水で90％アセトニトリル（B）に、0.1M TEAAです。 15分、20分の場合は0〜10％B、30分、10〜100％Bの0％B：アイソクラティック勾配を使用してください。 HPLCカラムを洗浄するために実行するまでの間に適用される洗浄5分100％Bを適用します。 代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="図1" /> 図1（右パネル）は、FLAG / 4 - SUと6 - SGでIGF2BP1 HA -タグを発現する細胞株を使用して実行PAR -クリップの代表的な結果を示しています。 IGF2BP1 6 - SGの架橋効率が4 - SUのための架橋効率よりも低いことに注意してください。低架橋効率が豊富な細胞のRNAのフラグメントに由来する配列の高いバックグラウンドになります、そのためには効率の低い光反応性ヌクレオシドを使用する際に、実験のスケールアップを検討する必要があります。 図1の左側のパネルには、潜在的に従来のUV 254nmの架橋に比べてPAR -クリップを使用することができる別の光反応性ウリジンアナログを使用しての比較を示しています。 正しい長さの放射性バンドの強度は、あなたにPAR -クリップ実験が働いていると、小さなRNAシークエンシングプロトコール（ステップバイステップの小さなのcDNAライブラリーの調製のための記述を通して運ぶために十分なRNAを単離しているかどうか良いアイデアを与えるRNAのシーケンシング）が19で見つけることができます。 6 - SGを使用して遷移する4 - SUおよびGを使用してCに遷移するために配列読み取り、Tの特徴的な変異の頻度は、成功した架橋シーケンスを示すものである。我々の経験では4 - SUで標識した未架橋のRNAは、約20％のバックグラウンドの突然変異率を示しています。この率は約に増加しています。架橋時に50から80パーセント。

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TTは、アルナイラムの医薬品への共同設立者と科学顧問とレグルスセラピューティクスのアドバイザーです。

バッファーと試薬成長培地HEK293細胞<ul><li> DMEM </li><li> 10％FBS </li><li> 2mMのL -グルタミン</li><li> 100 U / mlペニシリン</li><li> 100 U / mlのストレプトマイシン</li><li> 100μg/ mlのハイグロマイシン</li><li> 15μg/ mlのブラストサイジン</li></ul> 4チオウリジンストック溶液（1 M） <ul><li> 260.27 mgを4チオウリジン</li><li> 1ミリリットルDMSO </li></ul> Doxycyclin株式（10 mg / ml）を<ul><li> 10 mgのdoxycyclin </li><li> 1ミリリットルDMSO </li></ul> 1X NP40溶解バッファー DTTとプロテアーゼ阻害剤なしで5倍のバッファーの株式を準備します。実験の前に直接DTTとプロテアーゼ阻害剤を追加。 <ul><li> 50mMのHEPES、pH7.5の</li><li> 150mMのKClを</li><li> 2mMのEDTA </li><li> 1mMのNaFを</li><li> 0.5％（v / v）のNP40 </li><li> 0.5mMのDTT </li><li>完全なEDTA -フリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社） </li></ul>クエン酸 - リン酸緩衝液<ul><li> 4.7グラム/ lのクエン酸</li><li> 9.2グラム/ LのNa 2 HPO 4 </li><li> pH5.0で</li></ul> IP -洗浄緩衝液<ul><li> 50mMのHEPES - KOH、pH7.5の</li><li> 300mMのKClを</li><li> 0.05％（v / v）のNP40 </li><li> 0.5mMのDTT（実験の前に直接追加する） </li><li>完全なEDTA -フリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）（直接実験の前に追加） </li></ul>高塩洗浄緩衝液<ul><li> 50mMのHEPES - KOH、pH7.5の</li><li> 500mMのKClを</li><li> 0.05％（v / v）のNP40 </li><li> 0.5mMのDTT（実験の前に直接追加する） </li><li>完全なEDTA -フリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）（実験の前に直接追加する） </li></ul>脱リン酸化緩衝液<ul><li> 50mMトリス- HCl、pHを7.9 </li><li> 100mMのNaCl </li><li> 10mMのMgCl 2 </li><li> 1mMのDTT </li></ul>ホスファターゼの洗浄バッファー<ul><li> 50mMトリス- HCl、pH7.5の</li><li> 20 mMのEGTA </li><li> 0.5％（v / v）のNP40 </li></ul> DTTのないポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）バッファ<ul><li> 50mMトリス- HCl、pH7.5の</li><li> 50mMのNaCl </li><li> 10mMのMgCl 2 </li></ul> PNKバッファ<ul><li> 50mMトリス- HCl、pH7.5の</li><li> 50mMのNaCl </li><li> 10mMのMgCl 2 </li><li> 5mMのDTT </li></ul> SDS PAGEローディングバッファー<ul><li> 10％グリセロール（v / v）の</li><li> 50mMトリス- HCl、pH 6.8の</li><li> 2mMのEDTA </li><li> 2％SDS（w / v）の</li><li> 100mMのDTT </li><li> 0.1パーセントブロモフェノールブルー</li></ul> 2倍のプロテイナーゼKのバッファ<ul><li> 100mMトリス- HCl、pH7.5の</li><li> 150mMのNaCl </li><li> 12.5 mMのEDTA </li><li> 2％（w / v）のSDS </li></ul>

par-clip - a method to identify transcriptome-wide the binding sites of rna binding proteins

RNA転写産物は、RNA結合タンパク質（RBPs）とマイクロRNAを含む、多くの場合依存的細胞型において発現されるリボ核タンパク質複合体（miRNPs）の何百と相互作用することによって転写後の遺伝子発現制御に供される。これらのRNA結合因子の相互作用は、個々の転写産物の規制をどのように影響するかを理解するために、in vivoでのタンパク質- RNA相互作用での高解像度の地図は1が必要です。 遺伝的、生化学的および計算的アプローチの組み合わせは一般的にRNA - RBPまたはRNA - RNP相互作用を識別するために適用されます。免疫精製RBPsに関連付けられているRNAのマイクロアレイプロファイリング（RIP -チップ）2は、トランスクリプトームレベルでの目標を定義しますが、そのアプリケーションは、速度論的に安定な相互作用の特性に制限されており、のみまれに3,4 RBP認識の要素（RREを識別することができます）長い標的RNA中。より直接的なRBPのターゲットサイトの情報は、架橋RNAセグメントの分離とcDNAのシークエンシング（CLIP）10に続いて免疫沈降7月9日 の in vivoのUV架橋5,6 で結合することによって得られる。 CLIPはRBPs 11月17日の数のターゲットを識別するために使用されました。しかし、CLIPはUV 254 nmのRNA -タンパク質架橋の効率が低いことによって制限されており、架橋の位置は、それが困難な背景の非架橋からUV -架橋標的RNAセグメントを分離すること、塩基配列架橋フラグメント内に容易に識別可能ではないRNAはまた、サンプル中に存在するフラグメント。 我々は、高解像度と携帯RBPsとmiRNPsのトランスクリプトーム全体の結合部位で決定するために強力な細胞系架橋アプローチを開発している我々の用語PAR -クリップ（光活性化-リボヌクレオシド-強化された架橋と免疫）（概要は図1Aを参照してくださいメソッドの）。方法は、生きた細胞によって新生RNA転写物に、例えば4 - チオウリジン（4 - SU）と6 -チオグアノシン（6 - SG）のような光反応性リボヌクレオシド類縁体の取り込みに依存しています。 365nmの紫外光による細胞の照射は、相互作用RBPsに光反応性ヌクレオシド標識細胞のRNAの効率的な架橋を誘導する。興味のRBPの免疫沈降は、架橋と共免疫沈降RNAの分離が続いている。単離されたRNAは、cDNAライブラリーに変換し、深いSolexaの技術を用いて配列決定される。 PAR -クリップが作成したcDNAライブラリーの一つの特徴は、架橋の正確な位置を配列決定したcDNA内に存在する変異によって識別できることです。突然変異をアデノシンにグアノシンに6 - SGの結果を使用して、一方シチジンへの移行4 - SUを使用して、架橋のシーケンスはチミジン、。架橋配列における変異の存在は、豊富な細胞のRNAから由来する配列の背景からそれらを分離することが可能になります。 多様なRNA結合タンパク質の数に方式のアプリケーションは、ハーフナーらに報告されている。18

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PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA転写物は、トランス作用RNA結合タンパク質（RBPs）の多数によって媒介される大規模な転写後調節の対象となります。ここでは正確にとトランスクリプトーム全体の規模でRBPsのRNA結合部位を同定するために一般化の方法を提示する。

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

par-clip-method-to-identify-transcriptome-wide-binding-sites-rna

Research

JoVE Journal

Biology

53.2K ビュー.  Rockefeller University. RNA転写物は、トランス作用RNA結合タンパク質（RBPs）の多数によって媒介される大規模な転写後調節の対象となります。ここでは正確にとトランスクリプトーム全体の規模でRBPsのRNA結合部位を同定するために一般化の方法を提示する。

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

プルダウンカルモジュリン結合タンパク質の

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...