Ce travail a été soutenu par 115 347-RSG-08-271-01-GMC d&#39;ACS, et par CA138631 subventions du NIH.

Le protocole a été adapté de B. Ren, 2001. Il représente une légère modification du protocole par Odom et al. 5, qui se trouve à l&#39; <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pré-bloc et fixation de l&#39;anticorps à des billes magnétiques (doit être effectué la nuit avant l&#39;étape suivante) <ol><li> Lavez 100 uL d&#39;Dynabeads protéine G (par IP, se combinent pour plusieurs adresses IP) dans 1 ml de frais de BSA / PBS solution (50 mg de BSA dans 10 ml de PBS-Cette solution va durer une semaine). </li><li> Ramassez les perles en utilisant un support magnétique et répétez la procédure de lavage deux fois plus. </li><li> Ensuite, ajoutez 10 ug d&#39;anticorps à 250 pi de la bouillie de perles dans du PBS / BSA solution (par IP) et incuber pendant la nuit sur une plateforme rotative à 4 ° C. </li><li> À la fin, se laver les perles à trois reprises dans 1 ml de la solution de PBS / BSA et ensuite remettre en suspension dans 10 pl de la solution de PBS / BSA (par IP). </li></ol> 2. Cellule de réticulation <ol><li> Pour commencer cette procédure, croître d&#39;environ 10 8 cellules pour chaque immunoprécipitation, ou IP. Ici, diffuse histiocytaire cellules U937 lymphome sont utilisés et induit la différenciation monocytaire avec le TPA pendant 96 heures. </li><li> Suite à la croissance cellulaire, ajouter une solution de formaldéhyde directement aux médias à une concentration finale de 1%. Puis, tourbillon brièvement flacons et de leur permettre de reposer à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez les médias et rincer les cellules avec 15 ml de PBS glacé. Répéter ce lavage une fois. </li><li> Ensuite, ajoutez 6 ml d&#39;une mémoire tampon de lyse (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, glycérol 10%, 0,5% NP-40, 0,25% de Triton X-100, contenant des inhibiteurs de protéase) pour chaque des flacons sur la glace. Puis, le rock des flacons pendant 20 minutes à 4 ° C. </li><li> Enfin, la récolte des cellules à l&#39;aide d&#39;un grattoir de cellules et de les transférer à 15 ml tubes coniques. À ce stade, les cellules peuvent être stockés à -80 ° C. </li></ol> 3. Sonication cellulaire <ol><li> Si les cellules ont été congelées, les dégeler. Une fois décongelé, le spin des cellules vers le bas à 3000 rpm pendant 10 minutes à 4 ° C et jeter le surnageant. Ensuite, remettre en suspension les cellules dans 6 mL de 2 tampon de lyse (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, contenant des inhibiteurs de la protéase). Rock the tubes doucement à température ambiante pendant 10 minutes. </li><li> Répétez la centrifugation et la remettre en suspension les cellules dans 2,5 ml de 3 tampon de lyse (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,5 mM EGTA, désoxycholate de sodium 0,1%, 0,5% de N-lauroylsarcosine, contenant des inhibiteurs de protéase) . </li><li> Ensuite, préparer la suspension pour une sonication en le plaçant dans un bécher d&#39;eau glacée avec la micropointe d&#39;un Sonifier Branson 450 réglé entre 50 et 60% d&#39;amplitude. </li><li> Soniquer la solution pour un éclat constant 30 secondes et laisser refroidir sur glace pendant 1 minute. Répétez ces impulsions 10 à 15 fois. Puis, une pipette le contenu du tube de haut en bas et de les transférer dans un nouveau tube. Continuer à impulsions et refroidir la solution un supplément de 5 fois. </li><li> Après sonication, ajouter 10% de Triton X-100 à 1 / 10 du volume de solution. Transférer les lysats des tubes de 1,5 ml par centrifugation, et le spin des débris dans une microcentrifugeuse. Puis transférer le lysat cellulaire dans un nouveau tube. </li></ol> 4. Immunoprécipitation de la chromatine <ol><li> Avant immunoprécipitation de la chromatine, ou puce, économiser 50 uL du lysat cellulaire que l&#39;échantillon d&#39;entrée. Ensuite, mélanger le lysat cellulaire effacé avec Dynabeads pré-lié à un anticorps qui ont été préalablement préparés comme décrit ci-dessus. Rocher le mélange, en plus de l&#39;échantillon d&#39;entrée 50 uL, à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Laver les billes avec 1 mL de tampon de lavage (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1mM EDTA, le désoxycholate de sodium à 0,7%, 1% NP-40). Ensuite, utilisez un support magnétique pour recueillir les perles et retirer le surnageant. Répéter ce lavage 6 à 8 fois. </li><li> Effectuer un lavage final avec 1 ml de TE-plus-50 mM de NaCl (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM). Faites tourner les perles dans une microcentrifugeuse à 3000 rpm pendant 2 minutes à 4 ° C. Après la centrifugation, aspirer toute tampon résiduel TE. </li><li> Ensuite, ajouter 100 ul de tampon d&#39;élution (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 1%) pour les échantillons. Immédiatement après, incuber les échantillons à 65 ° C pendant 10 à 15 minutes. Grattez les tubes contre un rack tube de 1,5 ml toutes les 2 minutes pour maintenir les billes en suspension. </li><li> Ramassez les perles en utilisant la centrifugation et le support magnétique, et le transfert du surnageant dans un tube PCR. Ensuite, récupérer l&#39;échantillon d&#39;entrée précédemment enregistrés et ajouter 3 volumes de tampon d&#39;élution. </li><li> Enfin, placez les échantillons IP et d&#39;entrée dans le thermocycleur nuit à 65 ° C àinverser les liens croisés. </li><li> Le lendemain, ajouter 1 volume de tampon TE aux échantillons. Ensuite, ajoutez la RNase A à une concentration finale de 0,2 ug / uL. Incuber les échantillons dans le thermocycleur pour 1 à 2 heures à 37 ° C. </li><li> Après incubation, ajouter la protéinase K à une concentration finale de 0,2 ug / uL. Puis, incuber des échantillons dans le thermocycleur à 55 ° C pendant 2 heures. </li><li> Ensuite, extraire les échantillons une fois avec un volume de phénol. Extraire les échantillons une seconde fois avec un volume de phénol: chloroforme: alcool isoamylique. Enfin, l&#39;extrait les échantillons une fois de plus avec un volume de chloroforme: alcool isoamylique. </li><li> Ensuite, ajoutez 30 g de glycogène à chaque échantillon. En outre, ajouter du NaCl à une concentration finale de 0,2 volumes molaires et deux de l&#39;éthanol pour les échantillons. Laisser incuber pendant 30 minutes à -80 ° C. Après incubation, le spin des échantillons et décanter le surnageant. Lavez les boulettes avec 500 ul d&#39;éthanol à 75%. Ensuite, sécher les boulettes et remettre en suspension eux dans 40 ul d&#39;eau. </li><li> Pour vérifier la taille des fragments d&#39;ADN produites par la procédure sonication, charge 5 pg de l&#39;échantillon d&#39;entrée purifié dans un gel d&#39;agarose 1,8% et exécutez le gel. La procédure sonication devraient produire des fragments de l&#39;ordre de 150 à 350 paires de bases. Cependant, si les fragments ne tombent pas dans cette gamme, la procédure sonication doit être ajustée en faisant varier le nombre de salves et de l&#39;amplitude. </li><li> Pour vérifier la robustesse et la spécificité de puce, l&#39;enrichissement dans les régions de contrôle obligatoires en effectuant spécifiques du gène par PCR avec 1 pl des échantillons IP et une série de dilution de l&#39;échantillon d&#39;entrée. Deux à trois «lié» des régions et une région de contrôle indépendant doivent être sélectionnés en vue de tester la qualité des échantillons IP et d&#39;entrée. </li></ol> 5. Amplification de l&#39;ADN génomique <ol><li> A partir de 34 pl de l&#39;échantillon IP ou 200 ng de l&#39;échantillon d&#39;entrée, effectuer la réparation fin, &#39;A&#39; plus la queue et la ligature des adaptateurs pour utiliser des fragments d&#39;ADN génomique échantillon d&#39;ADN Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc, San Diego, Californie). </li><li> Purifier l&#39;ADN en utilisant un kit de purification MinElute PCR puis éluer de tampon EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) qui a été pré-chauffé à 50 ° C. Par exemple, utiliser 23 uL et 46 uL pour l&#39;élution finale de la PI et des échantillons d&#39;ADN d&#39;entrée, respectivement. </li><li> Faire de la réaction PCR en utilisant 23 uL d&#39;ADN avec des adaptateurs, et 25 uL d&#39;ADN polymérase Phusion du kit, 1 pl de 20 pM Sol_PCR_1, et 1 ul de 20 pM Sol_PCR_2. Exécutez la réaction PCR comme suit: 1) 30 secondes à 98 ° C; 2) 10 secondes à 98 ° C; 3) 30 secondes à 65 ° C; 4) 30 secondes à 72 ° C; on répète les étapes étape 2-4 18 fois, puis 5 minutes à 72 ° C, enfin maintien à 4 ° C. </li><li> Après amplification par PCR, de purifier l&#39;ADN avec le kit QIAGEN MinElute PCR Purification. Préchauffer 15 ul de tampon EB à 50 ° C et éluer l&#39;ADN. Diluer 0,5 uL de l&#39;échantillon et 01h04 effectuer une lecture Nanodrop. </li></ol> 6. Purification sur gel des produits amplifiés <ol><li> Pour purifier les produits amplifiés, préparer un gel d&#39;agarose 1,8% de 50 ml en utilisant l&#39;eau de qualité CLHP. Ajouter TAE et le bromure d&#39;éthidium après l&#39;agarose a fondu. Ensuite, versez le gel. Chargez le gel après l&#39;ajout de 4 pi de tampon de chargement à l&#39;entrée et des échantillons de propriété intellectuelle. Ensuite, exécutez le gel à 120 volts pendant 45 minutes. </li><li> Analyser le gel après leur exécution. Le gel doit révéler que des fragments dans la gamme entre 150 et 350 paires de base sont produites. Ils représentent des fragments d&#39;ADN génomique entre 50 et 250 paires de base de longueur et d&#39;un adaptateur. </li><li> Accise de la région du gel contenant le matériau dans la gamme de 150 350 paires de base avec un scalpel. Prenez soin d&#39;éviter l&#39;excision la bande adaptateur adaptateur, qui fonctionne à environ 120 paires de bases. Récupérer l&#39;ADN en utilisant un kit QIAquick Gel Extraction selon les instructions du fabricant. Plus précisément, l&#39;utilisation d&#39;une colonne du kit QIAquick Gel Extraction d&#39;une tranche de gel de 400 mg ou moins. Pour commencer le processus d&#39;extraction, ajouter 3 volumes de tampon QG pour 1 volume de gel. Ajouter 1 volume d&#39;isopropanol et de charger le mélange sur la colonne. Utiliser 0,5 ml de QG pour laver la colonne, suivie par la procédure standard décrite dans le kit manuel. Utilisez H 2 O préchauffée à 50 ° C pour éluer l&#39;ADN. Incuber la colonne avec 30 ul de H 2 O pendant 5 minutes à 37 ° C avant de filer vers le bas. </li><li> Sécher l&#39;échantillon jusqu&#39;à 11 uL précisément dans un Speedvac sans chaleur. Retirer 1 pl de l&#39;échantillon et de mesurer la concentration d&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre Nanodrop. </li><li> Enfin, identifier les produits de gènes enrichis utilisant le génome Illumina AnalyzerIIe comme décrit au <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. L&#39;objectif global de l&#39;expérience suivante est d&#39;identifier les cibles génomiques de KDM5A/JARID1A/RBP2 déméthylase histones. (P1) Ce résultat est obtenu par la préparation de la chromatine réticulée qui est soniqué pour produire des fragments d&#39;ADN de taille appropriée. (P2) Dans une deuxième étape, les fragments d&#39;ADN liés RBP2 sont immunoprécipités avec RBP2 anticorps. (P3) Ensuite, les fragments d&#39;ADN récupérés sont réparés aux extrémités et les adaptateurs sont ligaturés sur les extrémités de l&#39;ADN génomique pour préparer des bibliothèques d&#39;ADN génomique pour l&#39;analyse sur les cellules d&#39;écoulement dans la station Pôle Illumina. Les banques d&#39;ADN sont amplifiés par PCR en utilisant le faible nombre de cycles. (P4) Enfin, Illumina séquencé courtes lectures sont alignés de façon unique au génome humain, des pics significatifs sont identifiés et annotés à la plus proche des gènes afin d&#39;identifier les régions RBP2 enrichi. (P5) Les résultats sont obtenus montrent que les fonctions moléculaires associés à RBP2 gènes cibles basées sur l&#39;échelle du génome l&#39;identification des régions enrichi RBP2. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Vérification des résultats de sonication chromatine Pour vérifier la taille des fragments d&#39;ADN produites par la procédure sonication, 5 ug (1 / 10) de l&#39;échantillon d&#39;entrée purifiée a été chargé sur 1,8% gel d&#39;agarose. Comme prévu, notre procédure sonication produit des fragments de l&#39;ordre de 150 à 350 pb. Cependant, si les fragments ne tombent pas dans cette gamme, la procédure sonication doit être ajustée en conséquence, en faisant varier le nombre de salves et de l&#39;amplitude. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Purification sur gel des produits amplifiés. Les produits de PCR sont exécutées sur un gel pour éliminer les adaptateurs et sélectionnez un format de gamme de modèles pour la génération de plateforme cluster. Ce gel montre que des fragments dans la gamme entre 150 et 350 paires de bases ont été produites. Ils représentent des fragments d&#39;ADN génomique entre 50 et 250 paires de base de longueur et d&#39;un adaptateur. Nous accise de la région sélectionnée de gel avec un scalpel. Des précautions doivent être prises pour éviter la bande adaptateur adaptateur, qui fonctionne à environ 120 paires de bases. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Isoform anticorps spécifiques permet de distinguer entre les grandes et petites isoformes du RBP2. RBP2 la structure des protéines est présenté en vue de domaine. RBP2 contient plusieurs domaines: le catalyseur d&#39;histone déméthylation JmjC domaine et associés JmjN domaine, un domaine ARIDES capable de séquences de liaison spécifique de l&#39;ADN, un doigt de zinc C5HC2 qui peuvent potentiellement interagir avec l&#39;ADN ou d&#39;autres protéines, et de multiples domaines PHD. Les deux anticorps anti-RBP2 qui permettent la distinction entre RBP2 isoformes ont été tirées contre le RBP2 fragments indiqués par des lignes épaisses. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Figure 5a" /> La figure 5a. Vue d&#39;ensemble des régions RBP2 de liaison ainsi que des chromosomes et les gènes Ensembl. Coordonnées génomiques de RBP2 identifié enrichi (toutes les isoformes et de l&#39;isoforme de grande taille) des régions de liaison sont présentés chromosomes sage. Occupances de gènes Ensembl (version 54; hg18) dans les chromosomes (le chromosome 10 dans cette image) sont présentés comme des barres noires (panneau supérieur). Chaque région RBP2 liaison est représentée par une ligne verticale, où le panneau du milieu montre toutes les isoformes RBP2 régions de liaison sur le chromosome 10, et le panneau du bas montre RBP2 régions isoforme grande contraignant. Le milieu et en bas des panneaux donnent aperçu de chevauchement et de l&#39;occupation spécifique de RBP2 isoformes sur le chromosome 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Figure 5b" /> La figure 5b. L&#39;analyse d&#39;enrichissement fonctionnel de RBP2 gènes cibles. Heatmap montrant FDR corrigée de façon significative (valeur p ≤ 0,05) enrichi GO catégories Fonction moléculaire entre les gènes liés (le plus proche des gènes de la région RBP2 contraignante) par RBP2 (isoformes tous et de grande taille). Couleurs vers le rouge indiquent la significativité statistique élevé, jaune indique une signification statistique faible, et le gris indique l&#39;absence de signification statistique. L&#39;analyse d&#39;enrichissement montre les chevauchements et isoforme spécifique des fonctions moléculaires de RBP2 gènes cibles.

<ol>
	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

Les différences fonctionnelles entre RBP2 isoformes n&#39;ont pas été déterminées. Nous avons utilisé une approche globale pour identifier les régions génomiques liés par RBP2 isoformes et de définir les catégories fonctionnelles que ces régions représentent. Cela a été accompli par ChIP-Seq analyse suivie par l&#39;analyse bioinformatique des séquences obtenues lit. RBP2 modifie méthylé résidus lysine sur la queue des histones. Nous avons constaté que RBP2 isoforme de grande taille contenant le module de reconnaissance pour méthylé isoforme histone petite lysine et RBP2 dépourvues de ce module pour lier les différentes régions dans le génome humain (figure 5A). Surtout, l&#39;isoforme spécifique des régions et des régions qui se chevauchent appartiennent à des gènes de différentes fonctions moléculaires (figure 5B). Par exemple, «chromatine contraignante&quot; et &quot;facteur de transcription liant« les fonctions peuvent être attribuées à des gènes cibles RBP2 isoforme petit mais pas des RBP2 isoforme de grande taille (figure 5B). En comparant les gènes réels générés pour tous les ensembles et les isoformes RBP2 isoforme de grande taille (données non présentées), on peut aussi définir si l&#39;isoforme grande est spécialement recruté pour certains gènes.

Séquences oligonucléotidiques 2006 Illumina, Inc Tous droits réservés. <ul><li> Sol_PCR_1 Séquence 5&#39;-AAT GCG GAT ACG CAC CAC GAG ATC ATC LOI CTT TCC CTA CAC GAC TGC CTT GCC ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Séquence 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC CGA ATA GCT ATC CTT GCC T-3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

Le recrutement de facteurs transcriptionnels et épigénétiques de leurs objectifs est une étape clé dans leur régulation. Place de choix dans le recrutement sont les domaines de protéines qui se lient aux modifications des histones spécifiques. Un domaine est l&#39;homéodomaine plante (PHD), trouvés dans plusieurs chromatine des protéines de liaison. Le facteur de RBP2 épigénétique a de multiples domaines PHD, cependant, ils ont des fonctions différentes (figure 4). En particulier, le C-terminale du domaine PHD, a trouvé dans une fusion RBP2 oncogènes dans la leucémie humaine, se lie à triméthylée lysine 4 de l&#39;histone H3 (H3K4me3) 1. La transcription correspondant à l&#39;isoforme RBP2 contenant le PHD C-terminale s&#39;accumule pendant la différenciation des promonocytaire, lymphomes dérivés, les cellules U937 en monocytes 2. Conformément aux deux ensembles de données, l&#39;analyse du génome entier ont montré que dans les cellules U937 différenciées, la protéine localisée à RBP2 obtient régions génomiques hautement enrichi pour H3K4me3 3. Localisation des RBP2 à ses objectifs en corrélation avec une diminution due à H3K4me3 RBP2 activité déméthylase histone et une diminution de l&#39;activité transcriptionnelle. En revanche, deux doctorats autres RBP2 sont incapables de se lier H3K4me3. Notamment, le domaine C-terminal de doctorat de RBP2 est absent dans la petite RBP2 isoforme 4. Il est concevable que l&#39;isoforme de la petite RBP2, qui manque d&#39;interaction avec les H3K4me3, diffère de la grande isoforme de localisation génomique. La différence de localisation génomique des RBP2 isoformes peuvent rendre compte de la diversité observée dans RBP2 fonction. Plus précisément, RBP2 est un acteur essentiel dans la différenciation cellulaire médiée par la protéine du rétinoblastome (pRB). Conformément à ces données, l&#39;échelle du génome précédente analyse, sans distinction entre les isoformes, a identifié deux groupes distincts de gènes cibles RBP2: 1) les gènes liés par RBP2 d&#39;une manière qui est indépendante de la différenciation, 2) les gènes liés par RBP2 dans une différenciation manière dépendante. Pour identifier les différences de localisation entre les isoformes nous avons effectué une analyse du génome entier emplacement par ChIP-Seq. En utilisant des anticorps qui permettent de détecter à la fois RBP2 isoformes nous avons localisé l&#39;ensemble RBP2 cibles. En outre, nous avons des anticorps qui se lient seulement grand, et pas de petits RBP2 isoforme (Figure 4). Après l&#39;identification des cibles isoforme grande, on peut alors les soustraire de toutes les cibles RBP2 pour révéler les cibles de l&#39;isoforme de petite taille. Ces données montrent la contribution de la chromatine en interaction de domaine dans le recrutement de protéines pour ses sites de liaison dans le génome.

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Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Ici, nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) procédure pour analyse de la localisation du génome entier d&#39;isoformes de protéines qui diffèrent dans un domaine histone-contraignant. Nous sommes en l&#39;appliquant à ChIP-Seq analyse pour identifier les cibles de la déméthylase KDM5A/JARID1A/RBP2 histones.

Analyse du génome entier en utilisant ChIP d&#39;identifier les gènes cibles spécifiques Isoform

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.4K vues.  University of Illinois Chicago - UIC. Ici, nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) procédure pour analyse de la localisation du génome entier d'isoformes de protéines qui diffèrent dans un domaine histone-contraignant. Nous sommes en l'appliquant à ChIP-Seq analyse pour identifier les cibles de la déméthylase KDM5A/JARID1A/RBP2 histones.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

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Biologie

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

L&#39;échelle du génome Analyse des aminoacylation (recharge) Niveaux d&#39;ARNt utilisant des microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l&#39;échelle écrans ARNi dans C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel bayésienne changement de point Algorithme pour l&#39;échelle du génome Analyse des données ChIPseq divers types de

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

La cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)