Nous remercions M. Hajime Ichijo pour des conseils d&#39;enregistrement vidéo et utiles pour l&#39;édition de la vidéo. Nous remercions également Drs.Yuji Tsunekawa et Kaichi Yoshizaki pour l&#39;assistant genre pour l&#39;enregistrement vidéo. Ce travail est soutenu par KAKENHI sur B Young Scientist et sur la science du cerveau domaines prioritaires-moléculaire de MEXT du Japon. Nous reconnaissons l&#39;appui de Global COE Program &quot;centre de recherche fondamentale et translationnelle pour les sciences du cerveau global&quot; du MEXT du Japon et de la recherche de base pour la science évolutive et la technologie (CREST) ​​de la Science et Technology Corporation japonaise de Science and Technology Agency japonaise (JST) .

1. Mise en place du système de CME <ol><li> Joint une membrane de 0,22 um de filtre sur le tube de silicone entrée dans le système de CME a). </li><li> Ouvrez le robinet d&#39;une bouteille de gaz contenant O 2 (95%) et de CO 2 (5%). Débit du mélange gazeux dans le tambour par l&#39;intermédiaire de la bouteille contenant de l&#39;eau bouillonnante autoclave. </li><li> Régler le volume d&#39;écoulement du mélange gazeux à 50 cc. </li><li> Insérez le tube de silicone à laisser dans une bouteille d&#39;eau et vérifier le flux de mélange gazeux. </li><li> Tournez le tambour à la vitesse de 20 tr / min. </li></ol> 2. Préparation du milieu de culture <ol><li> Décongelez-rat, immédiatement centrifugé (IC) sérique à 37,0 ° C b). Ajouter D-glucose (2 mg / ml) dans le sérum dégelé dans un autoclave bécher de 100 ml. Le milieu de culture doit être préparé au niveau de la culture primaire (par exemple, en utilisant un capuchon). </li><li> Ajouter aux antibiotiques antimycosiques (100X) liquide à l&#39;sérum avec 1: 400 dilution. </li><li> Vaporiser l&#39;isoflurane restants (à cause de l&#39;anesthésie des rats pendant la collecte de sang) dans le sérum pendant 20 minutes à température ambiante (TA) c). </li><li> Stériliser le milieu de culture en utilisant un filtre de 0,45 um membrane. </li><li> Verser 3,0 ml de milieu dans chaque flacon de culture et de sceller le dessus de chaque flacon avec un bouchon de silicone, recouvert d&#39;une feuille d&#39;aluminium (voir réf. 14) d). </li><li> Préparer trois ou quatre boîtes de Petri contenant la disposition e salines de Tyrode). </li></ol> 3. Anesthésie du rat et de l&#39;isolement de l&#39;utérus <ol><li> Anesthetize un rat chronométré enceintes profondément avec anesthésiques par inhalation ou par voie parentérale. </li><li> Nettoyez la zone abdominale du rat anesthésié enceinte avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Ramasser la peau avec une pince et extérioriser la paroi abdominale en coupant la peau avec de grands ciseaux f). </li><li> Ramassez la paroi abdominale avec une paire de pinces et de faire en U de grandes incisions longitudinales sur la paroi abdominale avec des gros ciseaux à la g niveau thoracique). </li><li> Ours loin de l&#39;intestin vers le côté gauche avec une paire de pinces et d&#39;exposer une extrémité de l&#39;utérus reliés à l&#39;ovaire. </li><li> Ramassez la fin de l&#39;utérus avec une pince et de réduire la position entre l&#39;utérus et des ovaires avec des gros ciseaux. </li><li> Sortez de l&#39;utérus de la rate gestante en coupant la graisse autour de l&#39;utérus jusqu&#39;à l&#39;autre extrémité de l&#39;utérus. </li><li> Transfert de l&#39;utérus pour une boîte de Pétri contenant une solution saline de Tyrode. </li><li> Euthanasier le rat par l&#39;administration excessive d&#39;anesthésiques ou la dislocation cervicale après avoir enlevé l&#39;utérus. </li></ol> 4. Suppression des embryons dans l&#39;utérus <ol><li> Rincer brièvement l&#39;utérus dans une solution saline de Tyrode et le transférer sur le deuxième plat de Pétri avec une paire de pinces fines h). </li><li> Sous un microscope binoculaire, ramasser la paroi utérine avec une paire de pinces fines et découper la paroi utérine du côté opposé à l&#39;mésométrium connexion avec les vaisseaux sanguins à l&#39;aide des ciseaux ophtalmiques droite. </li><li> Insérer la pointe de ciseaux ophtalmiques droites dans l&#39;espace entre la paroi utérine et la caduque. Couper la paroi utérine longitudinalement le long du côté antimesometrial. </li><li> Clump la caduque sur le côté et le conceptus mesometrial séparer de l&#39;utérus à l&#39;aide de deux paires de pinces fines i). </li><li> Transfert à l&#39;conceptus troisième plat de Pétri avec une pipette en verre stérilisé avec un diamètre approprié. </li></ol> 5. Dissection d&#39;embryons de rat <ol><li> Insérez une extrémité de la microforceps dans la decidua et faire une incision transversale sur la decidua autour du conceptus avec deux paires de pinces. </li><li> Insérez le bout de la pince dans la decidua sur le côté du placenta et de faire deux incisions longitudinales sur la caduque au sommet. </li><li> Retirez la caduque placentaire sur le côté en arrachant qu&#39;avec deux paires de pinces. Retirez la decidua restant avec deux paires de pinces. </li><li> Ramassez la membrane de Reichert, faire une incision horizontale sur elle, et séparée de la membrane du conceptus sur le côté anti-placentaire. </li><li> Faire un petit trou sur le sac vitellin près de la tête de l&#39;embryon avec les deux paires de pinces, et couper le sac vitellin avec une paire de ciseaux courbes ophtalmiques. Il est important de ne pas endommager les vaisseaux sanguins principaux. </li><li> Ramassez l&#39;amnios sur le site autour de la tête de l&#39;embryon avec les deux paires de pinces fines, et tirez délicatement l&#39;embryon à partir du sac vitellin en déchirant l&#39;amnios h). Le corps de l&#39;embryon doit être retiré du sac vitellin d&#39;augmenter l&#39;apport d&#39;oxygène pour l&#39;embryon au stade midgestation. </li></ol> 6. La culture d&#39;embryons entiers <ol><li> Vérifiez les dommages sur le placenta, sac vitellin, et la condition de battre le cœur et la circulation sanguine. </li><li> Être conscient de ne pas étirer le cordon ombilical, le transfertl&#39;embryon d&#39;un flacon de culture avec une pipette en verre stérilisé. Report d&#39;une solution saline de Tyrode à des bouteilles de culture devrait être aussi peu que possible. </li><li> Retirer un bouchon de silicone non-trous du tambour des rotateurs. Connecter le flacon de culture avec un bouchon avec un trou dans le tambour de rotateurs du système de CME perpendiculairement. Soyez prudent de ne pas mettre la force sur le tambour dans des directions impropres depuis le tambour des rotateurs est un équipement très fine. Les bouteilles contenant de l&#39;embryon disséqués sont transférés à la culture, un par un, l&#39;ouverture de la porte avant de l&#39;incubateur doit être minimisée pour éviter que la température de l&#39;incubateur est diminué j). </li><li> Après 10 h de culture, d&#39;augmenter le volume des flux de mélange gazeux jusqu&#39;à 75 cc et 100 cc après 24 h (tableau 1). </li><li> Le milieu de culture doit être changé environ 24 h par le transfert de l&#39;embryon cultivé dans une bouteille nouvelle culture avec un milieu fraîchement préparé. Augmenter le volume du débit jusqu&#39;à 125 cc après 34 h et jusqu&#39;à 150 cc après 48 heures (tableau 1) </li><li> Occasionnellement vérifier l&#39;état des embryons cultivés en comptant rythme cardiaque (par exemple, 120-150/min est optimale) et en observant la circulation sanguine. Si nécessaire de compter le nombre de somites de juger de la croissance des embryons dans une solution saline de Tyrode. Dans le développement normal, un somite est ajouté en deux heures. </li><li> Lorsque le CME est terminée, arrêtez la fourniture de mélange de gaz et débrancher le tube d&#39;entrée et le filtre à membrane pour éviter le refoulement dans le tube d&#39;entrée de la bouteille de bulles. </li></ol> 7. Remarques <ol class="lalpha"><li> La température à l&#39;intérieur du système de CME est constamment maintenu à 37,0 à 37,5 ° C. </li><li> 100% du rat IC sérum est utilisé en routine dans notre CME pour les embryons de rat et de souris, et conservés à -20 ° C avant utilisation. </li><li> Nous achetons chez le rat IC sérum, qui est recueillie à partir de rats qui sont anesthésiés à l&#39;isoflurane. </li><li> Bouteilles jetables sont également disponibles auprès de Ikemoto Rika. Bouteilles et bouchons de silicone doivent être autoclavés. </li><li> Dissection d&#39;embryons doit être réalisée à température ambiante car le maintien des embryons à basse ou haute température lors de la dissection affecter le développement ultérieur de CME. </li><li> Outils pour la dissection sont stérilisés par chaleur sèche. </li><li> La peau et la paroi abdominale doit être coupée séparément pour éviter la contamination des poils dans un plat que possible. Nous changeons d&#39;une paire de gros ciseaux et des pinces avec une nouvelle paire d&#39;entre eux lorsque nous avons coupé la peau et d&#39;isoler de l&#39;utérus, respectivement. </li><li> En utilisant des pinces dont les extrémités sont fines est très important de disséquer les tissus certainement. Nous manuellement aiguiser les pointes de forceps avec une pierre et l&#39;huile de machine. </li><li> Nous utilisons un côté de la pince comme un couteau pour éviter une pression excessive pour les embryons. </li><li> Lorsque la température à l&#39;intérieur du système de CME diminue en ouvrant la porte à plusieurs reprises, nous continuons à allumer la lumière pour garder la température à l&#39;intérieur du système. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs La figure 1 montre les procédures de dissection de l&#39;embryon de rat et d&#39;embryons de rat en culture. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Culture d&#39;embryons entiers de l&#39;embryon E12.5 rat. (A) Une conceptus disséqué de l&#39;utérus de la rate gestante. (B) retrait de la caduque du côté du placenta. (C) l&#39;enlèvement de la membrane de Reichert. (D) L&#39;ouverture du sac vitellin. (E) La culture d&#39;embryon de rat dans la bouteille pendant 6 heures après le début du WEC. (F) L&#39;embryon de rat en culture pour 42 hr. d, caduque; R; membrane de Reichert; p, le placenta; ys, sac vitellin; e, embryon. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 h </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td><td> 36 h </td><td> 48 h </td></tr><tr><td> E12.5 embryon de rat </td><td> 95% 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 h) </td><td> 95% 100 cc </td><td> 95% 125 cc (34 h) </td><td> 95% de 150 cc </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Condition de l&#39;oxygène optimale.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mammalian+embryos.">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).</li><li>Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. 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Res. 63, 2-9 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li></ol>

Il ya deux étapes essentielles dans la CME rongeurs pour le succès. Tout d&#39;abord, la procédure de dissection doit être juste pour ne pas endommager les embryons, en particulier les vaisseaux sanguins. Deuxièmement, la procédure devrait être aussi rapidement que possible parce que l&#39;oxygène et les nutriments ne sont plus alimentés via le placenta après l&#39;isolement de l&#39;utérus. Cela est essentiel pour les anciens embryons. Dans le cas du WEC rat après E12.5, nous devrions le transfert des embry...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Tapez </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td colspan="5"> Mise en place du CME </td></tr><tr><td> WEC système (10-0310) </td><td> Outil </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Un autre petit modèle est également disponible. </td></tr><tr><td> Plug Silicon sans trou </td><td> Outil </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Cylindres mélange de gaz </td><td> Outil </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> Contenant au moins 95% d&#39;oxygène et de dioxyde de carbone de 5%. Afin personnalisé. </td></tr><tr><td> Le régulateur de gaz </td><td> Outil </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um filtre Millex GS </td><td> Outil </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> L&#39;anesthésie et l&#39;isolement de l&#39;utérus </td></tr><tr><td> Gros ciseaux </td><td> Outil </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Outil </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Élimination boîte de Petri (90 mm x 15 mm) </td><td> Outil </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Deep-type de plat est le meilleur pour la dissection. </td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> Réactifs </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Pour l&#39;anesthésie </td></tr><tr><td> Pentobarbital sodique </td><td> Réactifs </td><td> Santé animale de Schering-Plough </td><td> - </td><td> Pour l&#39;anesthésie </td></tr><tr><td> Tyrode salines </td><td> Réactifs </td><td> - </td><td> - </td><td> Selon que le protocole de Réf. 2. Enregistrer à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Timed-rates Sprague-Dawley rats </td><td> Des animaux </td><td> Charles Rivers Laboratories au Japon </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Préparation du milieu de culture </td></tr><tr><td> Bouteille en verre de la culture </td><td> Outil </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Flacon de culture élimination </td><td> Outil </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Plug Silicon avec trou </td><td> Outil </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Le papier d&#39;aluminium </td><td> Outil </td><td> Toute entreprise </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Sac autoclavage </td><td> Outil </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Pour les bouteilles de la culture </td></tr><tr><td> Sac autoclavage </td><td> Outil </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> Pour les bouchons de silicone </td></tr><tr><td> 0,45 um filtre Millex HA </td><td> Outil </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tube conique </td><td> Outil </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Bécher de 100 ml </td><td> Outil </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC sérique </td><td> Réactifs </td><td> Charles Rivers Laboratories au Japon </td><td> - </td><td> Reportez-vous à: M. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336 Fax: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+)-Glucose </td><td> Réactifs </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotiques antimyotic liquides </td><td> Réactifs </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Dissection d&#39;embryons </td></tr><tr><td> Ciseaux ophtalmique droites </td><td> Outil </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Pour la coupe de la paroi utérine </td></tr><tr><td> Des ciseaux courbes ophtalmique </td><td> Outil </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Pour couper le sac vitellin </td></tr><tr><td> Pince # 5 </td&gt; <td> Outil </td><td> Vigueur </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Pince # 5F </td><td> Outil </td><td> Régine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Verre pipette </td><td> Outil </td><td> - </td><td> - </td><td> Fait à la main en utilisant une pipette Pasteur. </td></tr><tr><td> Sac autoclavage </td><td> Outil </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Pour pipettes en verre </td></tr><tr><td> Microscope binoculaire </td><td> Outil </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Lumière </td><td> Outil </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Huile de pierre </td><td> Outil </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Pour l&#39;affûtage des forceps </td></tr><tr><td> Huile de machine </td><td> Outil </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Pour l&#39;affûtage des forceps </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

Toute la culture d&#39;embryons (CME) technique a été développée en 1950 par la Nouvelle et ses collègues, et appliquée pour la biologie du développement 1. Bien que le développement et la croissance des embryons de mammifères dépendent de façon critique sur la fonction du placenta, la technique du CME nous permet de culture et de la souris embryons de rat ex vivo état ​​pendant des périodes limitées correspondant aux stades lors de midgestation jour embryonnaire (E) de 6,5 E12.5 dans le souris ou E8.5-E14.5 chez le rat 2, 3, 4. Dans le CME, nous pouvons cibler directement les zones souhaitées en utilisant des embryons fines capillaires en verre car les embryons peuvent être manipulés sous le microscope. Par conséquent, le CME rongeurs est une technique très utile quand on veut étudier les processus dynamiques de développement des embryons de mammifères postimplanted. Jusqu&#39;à ce jour, plusieurs types de systèmes de CME ont été développés 1. Parmi ceux-ci, le système des rotateurs de type flacon de culture est le plus populaire et adapté à long terme de culture d&#39;embryons au midgestation, c&#39;est à dire, après E9.5 et E11.5 chez la souris et le rat, respectivement 1. Dans ce protocole vidéo, nous démontrons notre procédures standard du CME rat après E12.5 en utilisant un modèle raffiné de l&#39;ancien système des rotateurs, qui a été conçu par la Nouvelle et de Cockroft 5, 6, et d&#39;introduire diverses applications de la technique du CME pour les études en développement chez les mammifères biologie.

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The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole technique de culture d&#39;embryons de souris nous permet de culture et d&#39;embryons de rat<em&gt; Ex vivo</emCondition&gt; durant des périodes limitées correspondant aux stades midgestation. Dans ce protocole vidéo, nous démontrons nos procédures standard de la culture d&#39;embryon de rat entière après E12.5 en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture.

La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.6K vues.  Tohoku University Graduate School of Medicine. Whole technique de culture d'embryons de souris nous permet de culture et d'embryons de rat Ex vivo durant des périodes limitées correspondant aux stades midgestation. Dans ce protocole vidéo, nous démontrons nos procédures standard de la culture d'embryon de rat entière après E12.5 en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

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Biologie

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

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Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

La méthode la Culture Slice pour la suite du développement des germes de dents dans explantation Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d&#39;embryons de mammifères entier

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Évaluation des propriétés angiogénétiques des cellules souches du cancer de l’ovaire à l’aide du système de co-culture tridimensionnel, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.

Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte