Nous tenons à remercier le laboratoire de A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) et le laboratoire de L. Niswander (U of Colorado-Denver) pour des conseils utiles aux techniques de dissection et la culture. Ce travail a été soutenu par NRSA NS059562 au JDG et RO1NS05897 à MER, en collaboration avec L. et J. Niswander Nadeau (Institute for Systems Biology).

1. Préparation des milieux de culture - tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau 1 <ol><li> Sérum de rat mâle dégel à 37 ° C. </li><li> Chauffer inactiver le sérum de rat pendant 30 min à 55 ° C </li><li> Sérum de rat Centrifuger à 10K pendant 5 min à température ambiante </li><li> Retirer 50:50 surnageant et mélanger avec du phénol-rouge w gratuitement DMEM / glucose à haute </li><li> Stériliser les médias en utilisant un filtre de 0,45 um seringue </li><li> Au moins 1ml de médias / embryon devrait être préparé </li></ol> 2. Isolement de l&#39;utérus à partir du barrage enceinte <ol><li> En utilisant les procédures approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation (IACUC), le barrage de grossesse est d&#39;abord anesthésiés puis sacrifiés par dislocation cervicale </li><li> Stériliser l&#39;abdomen avec 70% EtOH </li><li> Pincez un petit chemin de la peau le long de la ligne médiane, juste au-dessus de la ligne du mamelon, avec une pince large et ouverte de l&#39;abdomen en dessous de votre forceps avec de grands ciseaux. Soyez prudent de ne pas endommager la structure internes </li><li> Utilisez vos ciseaux pour couper latéralement de l&#39;ouverture initiale vers les côtés de la souris pour que tout l&#39;abdomen est ouvert </li><li> Les intestins et l&#39;excès coussinets adipeux peuvent souvent obscurcir l&#39;utérus et ils devraient être écartés pour que le haut de l&#39;utérus et les ovaires peuvent être observées sur chaque côté </li><li> Pincez le haut de l&#39;utérus ci-dessous les ovaires et l&#39;utilisation de vos ciseaux pour séparer l&#39;utérus de la graisse, la coupe d&#39;une extrémité de l&#39;utérus à l&#39;ovaire d&#39;autres </li><li> Soulever l&#39;utérus avec votre pince et le placer dans une boîte de Pétri avec une solution saline </li></ol> 3. Suppression des embryons dans l&#39;utérus <ol><li> Rincer avec une solution saline dans l&#39;utérus pour enlever tout excès de sang et enlevez tout excès de graisse de l&#39;extérieur </li><li> Transférer dans un plat propre avec la température ambiante. Tyrodes saline pour améliorer la visualisation </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un stéréomicroscope, séparer chaque embryon en utilisant soit des petits ciseaux ou si fines nécessaires (# 5) pince pour détachez soigneusement l&#39;utérus en dehors. </li> &lt;li&gt; Insérer une pince fine dans l&#39;espace entre la paroi utérine et la caduque et peler la paroi utérine, en faisant attention à ne pas percer l&#39;embryon </li></ol> 4. Suppression des caduque à partir d&#39;embryons <ol><li> Orienter la caduque pour que le plus sombre partie (le placenta) est face à vous </li><li> Faire une incision avec votre pince le long de la ligne séparant la partie sombre de la caduque de l&#39;allume-partie, en faisant attention de ne pas couper trop profondément </li><li> Remplissez la séparation du placenta par le haut du sac vitellin, en faisant attention à ne pas déchirer l&#39;ectoplacentaire cône (EPC). A ce stade, vous devriez être capable de visualiser la membrane Reicherts sur le sac vitellin </li><li> Continuer à supprimer l&#39;ensemble de la decidua (légers partie) en faisant attention à ne pas percer le sac vitellin </li><li> Pincer doucement et retirer le Reicherts en l&#39;arrachement de la CBE. Si le CPE est endommagé ou séparé du sac vitellin, les embryons ne parviendra pas à tourner normalement à partir E8.5 E9.5- </li><li&gt; Avec le Reicherts retiré l&#39;embryon doit être facilement visible à travers le sac vitellin et peut être mis en scène par somities comptage. </li></ol> 5. Mise en place du système de culture <ol><li> Coupez l&#39;extrémité d&#39;une pipette de transfert en plastique avec des ciseaux pour augmenter le diamètre de l&#39;ouverture de telle sorte que l&#39;embryon peut être pipeté sans endommager le sac vitellin </li><li> Remplir les bouteilles à rouleaux propre avec 1 ml de milieu par embryon. Selon le type de bouteilles à rouleaux utilisés au maximum de 3-6 embryons peuvent être chargés dans chaque bouteille. </li><li> Transfert des embryons en utilisant votre pipette coupé à la bouteille à rouleaux supports rempli, transportant plus que Tyrodes peu que possible afin de ne pas diluer les médias </li><li> Fixez le bouchon en caoutchouc (bonde) au sommet de la bouteille en verre à rouleaux </li><li> Insérez le rouleau de bouteilles dans le tambour de la culture afin que les rouleaux un joint étanche est formé entre le bouchon et le tambour </li><li> Une fois que toutes les bouteilles ont été attachés, et tout emplacements vides dans le tambour ont été scellés avecbouchons en caoutchouc vec, activer le rouleau </li><li> Ouvrez le CO 2 et O 2 réservoirs et les ajuster à environ 2 psi, de sorte que la vanne de sortie publie une bulle par seconde. Pour E8.5-E10 embryons, 20% d&#39;O 2 et 5% de CO 2 devraient être utilisées. </li><li> Assurez-vous que l&#39;incubateur est fixé à 37 ° C et couvrir ou fermer l&#39;incubateur afin que les embryons sont à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Les embryons doivent être vérifiés périodiquement pour évaluer leur développement par l&#39;ajout de somities, la progression du tournage, et le degré de fermeture du tube neural </li><li> Après 2-3 heures de culture, les inhibiteurs pharmacologiques ou d&#39;autres traitements peuvent être ajoutées aux médias </li><li> L&#39;étude doit inclure des contrôles, tels que des véhicules ou des analogues inactifs de réactif étude. </li></ol> 6. Évaluer le développement après la culture de l&#39;embryon entier <ol><li> Coupez le gaz, arrêt au rouleau, et enlever les bouteilles de l&#39;incubateur </li><li> Embryons Transfert retour à Tyrodes ou de PBS dans une boîte de Petri pour l&#39;évaluation sous stéréomicroscope </li><li> Le sac vitellin devrait apparaître comme le ballon-, un battement de cœur doit être visible et la fréquence cardiaque doit être&gt; 120 battements par minute, et la circulation devrait être évident </li><li> Photographie embryons avant l&#39;enlèvement du sac vitellin, si nécessaire </li><li> Retirer le sac vitellin de l&#39;embryon en perçant un trou près de la CBE, et retournant le sac vitellin et l&#39;amnios sur la tête et la croupe de l&#39;embryon. </li><li> Le cordon ombilical peut être coupé pour séparer le sac vitellin de l&#39;embryon, et le sac vitellin peuvent être utilisés pour le génotypage de l&#39;embryon, si nécessaire. </li><li> Examiner l&#39;embryon pour le nombre des somites et des défauts du tube neural, telles que l&#39;ouverture des plis crânienne, fermeture incomplète de la face et / ou une neuropore ouverte caudale. Les embryons peuvent être organisées selon la classification de Theiler des changements morphogénétiques multiples ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html</a> ) Encore une fois, un dossier photographique desdéveloppement de l&#39;embryon est utile. </li></ol> 7. Remarques <ol><li> Une dissection de haute qualité est essentielle, car n&#39;importe quel pseudo ou déchirures dans le sac vitellin empêchera tourner avec succès et inhibent le développement normal. L&#39;EPC peuvent également être endommagés pendant l&#39;enlèvement de la membrane du Reichert (RM), et si le CPE est encore partiellement séparé de la vésicule ombilicale, les embryons ne se développera pas normalement. Cependant, l&#39;élimination incomplète de la RM peut causer des embryons de rester ensemble et / ou de cellules RM peuvent proliférer dans la culture et la constriction du sac vitellin d&#39;expansion, tant sur ce qui empêcherait un développement normal. </li><li> Pince propre et nette sont le secret pour obtenir une dissection bien, car une pince émoussée ou pliés rendre la procédure beaucoup plus difficile. Dépôts de protéines sur des instruments conduira à une lésion tissulaire. </li><li> Propre, bouteilles en verre stériles sont également essentielles pour prévenir les embryons de coller à la paroi latérale et être endommagé. Avant de commencer l&#39;expérience, les bouteilles doivent être scrubbed eau et au savon, rincés dans de dH 2 O, et au micro-ondes avec une petite quantité d&#39;eau dans chaque bouteille jusqu&#39;à ce que l&#39;eau bout. Les bouteilles sont ensuite rincés avec 70% EtOH et sécher à l&#39;air. </li><li> Le travail le plus rapidement possible, parce que le plus tôt l&#39;embryon peut être transféré à la culture et des médias réchauffé à 37 ° C, le meilleur taux de survie. </li><li> Remplissez disséquer la litière en entier avant de transférer des embryons à des flacons roulants de sorte que chaque embryon est à température ambiante pour la même quantité de temps pour éviter de créer toute anomalie dans la croissance des embryons </li><li> Maintenir un environnement stérile pour éviter la contamination bactérienne des cultures. Nos expériences de culture ont été effectués sans antibiotique, mais de nombreux laboratoires ajouter des antibiotiques à leurs médias pour prévenir la croissance bactérienne. Le milieu doit apparaître comme évident à la fin de l&#39;expérience comme il l&#39;était au début de l&#39;expérience. Si les médias est devenu nuageux ou il ya un précipité visible, il ya probablement un concontamination qui a infecté votre culture. </li><li> Échanges gazeux inefficace peut aussi retarder le développement des embryons, donc soyez sûr d&#39;avoir un régulateur fiable qui assurera la prestation continue. </li><li> Embryons se développent environ 50% plus lent dans la culture ex vivo, il est donc essentiel de compter somites pour s&#39;assurer que vous avez atteint le stade de développement approprié pour l&#39;achèvement de l&#39;expérience. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: L&#39;apparition d&#39;embryons pré-et post-roller culture est illustrée dans la Figure 1. Au moment de la dissection, les embryons doivent être dans une configuration hasard (fig. 1A, D) où la queue est derrière les plis tête. Après 36 heures de culture, les embryons doivent avoir terminé tourner de sorte qu&#39;ils soient dans le C-courbes, position fœtale, où la queue est en face de la tête (figure 1B, C, E, F). La manipulation pharmacologique avec RhoA inhibiteur de kinases (Y-27632), un inhibiteur connu de l&#39;extension convergentes au coursneurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), aboutit à un raccourcissement des embryons au long de leur rostrale-caudale axe (Fig. 1E, F) et inhibe la fermeture crânienne neurones pli. Nos données montrent que des doses croissantes de Y-27632 altère progressivement la fermeture crânienne fois (figure 2A) et raccourcit l&#39;axe du corps (fig. 2B), compatible avec le rôle de l&#39;aval de RhoA de signalisation dans la neurulation crâniens et extension convergente. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> Figure 1. Apparence des embryons et la manipulation des cultures avec l&#39;inhibiteur pharmacologique Y-27632. (A, D) embryons disséqués à E8.5 avant toute culture de l&#39;embryon (B, E) embryons à E10 avec le sac vitellin encore intacte, à la suite de 36hrs de la culture russes. (C, F) Le sac vitellin a été enlevée pour illustrer tourner avec succès et de fermeture du tube neural. Les embryons qui ont été traités avec l&#39;inhibiteur de la Rho kinase Y-27632 (E, F) a échoué à subir bonne extension convergente et d&#39;illustrerun axe du corps raccourcie. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> Figure 2. Effet inhibiteur de la kinase de la RhoA sur la fermeture du tube neural et l&#39;élongation du crâne axe. (A) Le pourcentage d&#39;embryons qui ont réussi à fermer leurs plis crânienne (NTC% = pourcentage de fermeture du tube neural) est comparée à la dose de Y-27632 ajoutée aux milieux de culture. (B) La distance entre la vésicule otique et des membres antérieurs a été significativement réduite à des doses croissantes de Y-27632 (p &lt;0,05).

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La capacité de séparer la mère, les facteurs intra-utérine de ceux qui sont intrinsèques à l&#39;embryon au cours de son développement est un outil important pour étudier tous les stades de l&#39;embryogenèse. Ici, nous avons analysé les effets d&#39;un inhibiteur de la kinase à petites molécules RhoA sur utero neurulation ex crânienne, ce qui élimine la variable du métabolisme de la mère de la drogue. Cette manipulation pharmacologique n&#39;a un effet profond sur la neurulation crâniens et extension convergente. La sensibilité à ce composé peut être comparée entre les différents mutants génétiques de souris. La méthode présentée ici peut également être appliquée à des études d&#39;autres voies moléculaires dans le développement, permettant la manipulation directe de la fonction cellulaire des embryons en utilisant une variété de réactifs.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Stéréomicroscope pour la dissection </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Précision Incubateur </td><td> BTC Engineering (Royaume-Uni) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Rotation Unité Culture Bouteille </td><td> CTB </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Bouteilles en verre pour unité rotative </td><td> CTB </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Bung </td><td> CTB </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Cork </td><td> CTB </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz Bubbler Inlet </td><td> CTB </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Piège d&#39;entrée de gaz Bubbler </td><td> CTB </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz Bubbler sortie </td><td> CTB </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Bouteille de gaz </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% d&#39;O 2, 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> Régulateur de gaz </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sérum de rat mâle </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM W / O rouge de phénol </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 10 ml </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre seringue </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Grand Ciseaux de dissection (Blunt pourboire) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Ciseaux de Bonn </td><td> Beaux-outils scientifiques (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 forceps </td><td> TSF </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode Saline </td><td></td><td></td><td> Comme décrit dans Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> 10 cm vaisselle jetable de Pétri </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

Modèles génétiques de souris sont un outil important dans l&#39;étude de la fermeture du tube neural chez les mammifères (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Cependant, l&#39;étude des embryons de souris in utero est limité par notre incapacité à manipuler directement pharmacologiquement les embryons dans l&#39;isolement des effets du métabolisme de la mère sur le réactif d&#39;intérêt. Que ce soit en utilisant une petite molécule, protéine recombinante, ou siARN, la livraison de ces substances à la mère, par l&#39;alimentation ou par injection sous réserve de ces composés instables à une variété de défenses corporelles qui pourraient les empêcher d&#39;atteindre l&#39;embryon. Enquêtes dans les cultures d&#39;embryons de l&#39;ensemble peut être utilisé pour séparer la mère du intrinsèques effets sur le fœtus sur le développement. Ici, nous présentons une méthode de culture des embryons de souris en utilisant les médias hautement enrichi dans un appareil à rouleaux incubateur qui permet de fermeture du tube neural normale après dissection (Crockett, 1990). Une fois dans la culture, les embryons peuventêtre manipulées en utilisant des techniques in vitro conventionnelle qui ne serait pas possible autrement si les embryons étaient encore dans l&#39;utérus. Frères et sœurs d&#39;embryon peuvent être recueillies à des moments différents pour étudier les différents aspects de la neurulation, survenant de E7-7.5 (la formation de la plaque neurale, juste avant le début de la neurulation) pour E9.5-10 (à l&#39;issue de neuropore plier et caudale du crâne fermeture, Kaufman, 1992). Dans ce protocole, nous démontrons notre méthode pour disséquer des embryons au timepoints qui sont optimales pour l&#39;étude de la neurulation crânienne. Les embryons seront disséqués à E8.5 (environ 10-12 somities), après l&#39;initiation de la fermeture du tube neural, mais avant de tourner l&#39;embryon et de fermeture crânienne neurones pli, et maintenues en culture jusqu&#39;à E10 (26-28 somities), quand crânienne neurulation doit être complète.

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Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Une méthode permettant la manipulation pharmacologique directe d&#39;embryons de souris au cours neurulation qui contourne le métabolisme de la mère est décrite. La technique peut être adaptée pour étudier les différents aspects de la neurulation en faisant varier le point dans le temps et l&#39;agent pharmacologique.

Fermeture du tube neural dans la culture Mouse Embryo entier

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K vues.  Weill Cornell Medical College. Une méthode permettant la manipulation pharmacologique directe d'embryons de souris au cours neurulation qui contourne le métabolisme de la mère est décrite. La technique peut être adaptée pour étudier les différents aspects de la neurulation en faisant varier le point dans le temps et l'agent pharmacologique.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Combinant endocrinologie du comportement et l&#39;économie expérimentale: Décision de la testostérone et social Rendre

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La détection de l&#39;hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...