Nous tenons à remercier Boast Sharon pour des discussions éclairées et de nombreuses B. Novitch pour le don nature des anticorps à FOXP1. Ce travail financé par une bourse du Wellcome Trust à KCT et une subvention de projet par le Wellcome Trust au SRP (Grant numéro de référence 094399/B/10/Z).

1. Assurez-Solutions obligatoires <ol><li> 1 tampon phosphate M:. Peser 109,4 g Na 2 HPO 4 et 32 g de NaH 2 PO 4 H 2 0, mélanger et dissoudre dans de l&#39;eau à un volume total de 1 litre. </li><li> Phosphate Buffered Saline (PBS): Préparer un tampon phosphate 0,1 M, 0,15 M de NaCl. 100 ml de PBS devrait suffire pour le traitement de tranches de 10 embryons. </li><li> Agarose: Heat solution de PBS à environ 70 ° C et ajouter solides de faible température de fusion d&#39;agarose lentement tout en remuant continuellement. Rendre la solution à une concentration finale de 4% (p / v) d&#39;agarose. Faire un bilan de 50 ml de cette solution. Laissez cette solution dans un bain d&#39;eau maintenu à 48 ° C jusqu&#39;à utilisation. Toute solution non utilisée d&#39;agarose après l&#39;expérience peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li><li> Solution d&#39;anticorps bloc: Ajouter sérum de veau foetal et le triton X-100 à une concentr finaleation de 1% (v / v) de sérum de veau foetal, 0,1% (v / v) de Triton X-100 dans du PBS. 10 ml de solution bloc suffira pour l&#39;immunomarquage de 5 lames de coupes au cryostat. </li><li> Fixateur: Préparer 0,75 mm NaOH, le paraformaldéhyde 4% (p / v) (ATTENTION). Pour préparer la quantité de chaleur nécessaire fixateur d&#39;eau à 70 ° C, ajouter du NaOH concentré à la concentration finale souhaitée, ajouter du paraformaldéhyde solide et mélanger jusqu&#39;à dissolution. Laisser refroidir sur glace à 4 ° C. 10 ml de cette solution sera suffisante pour 20 puits de tranches d&#39;embryons. </li><li> Solution de saccharose: Préparer 10 ml d&#39;une solution de saccharose à 30% (p / v) contenant 0,1 M de tampon phosphate. 10 ml de cette solution sera suffisante pour 10 puits de tranches d&#39;embryons. </li><li> 70% (v / v) d&#39;éthanol. Diluer 70 ml d&#39;éthanol absolu avec 30 ml d&#39;eau. </li><li> Milieu de culture: Préparer une solution d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet 1%, 1% de pénicilline / streptomycine, 0,35% de L-glutamine, 0,1% de 2-mercaptoethanol, poulet 4% de sérum, 2% B27 supplément et 100 ng / ml de facteur de croissance ciliaryneurotrophic (CNTF) tous dilués dans le milieu neurobasal, préparé sur la glace et a utilisé le même jour. 10 ml de milieu de culture est nécessaire pour des puits de 20 tranches d&#39;embryons. </li></ol> 2. Préparation d&#39;embryon de poussin <ol><li> Lieu oeufs fécondés de poules avec le côté le plus long horizontalement dans un incubateur projet forcée à 38 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils développent à l&#39;étape 15 24. Ceci requiert environ 4 jours d&#39;incubation. </li><li> Le deuxième jour de l&#39;incubation, la stérilisation de la coquille de l&#39;oeuf en l&#39;essuyant avec un mouchoir en papier imbibé d&#39;éthanol à 70%. Soigneusement percer l&#39;extrémité plate de la coquille d&#39;oeuf à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 21 fixée à une seringue de 5 ml et 5 ml de retirer l&#39;albumine. Cela réduit l&#39;embryon loin du réservoir de manière l&#39;embryon n&#39;est pas endommagé lorsque l&#39;enveloppe est ouverte. Remettez les oeufs dans l&#39;incubateur et les incuber pendant 2 jours. </li><li> Utilisation émoussée dumont N ° 5 forceps carefully percer le milieu, en haut de la coquille et de supprimer environ 9 cm 2 de coquille. Couper autour de l&#39;embryon et soulevez délicatement sur l&#39;embryon et le placer dans HBSS pendant la dissection. Les embryons doivent être mis en scène en fonction de Hamburger et Hamilton (1992) 15. Tous les embryons utilisés doivent être à proximité de stade 24. Les embryons qui montrent des signes d&#39;anomalie doit être jeté. </li><li> Enlever la membrane amnios, membrane chorio-allantoïde, la tête, et allantoïde l&#39;aide de deux dumont ° 5 forceps. Eviscération l&#39;embryon pour enlever tous les organes internes. Pour ce faire, couper la ligne médiane ventrale de l&#39;embryon avec micro ciseaux de dissection, maintenez l&#39;embryon dans la région rostrale du tronc avec une paire de pince, saisir la partie rostrale de l&#39;intestin et le cœur et tirez caudale. Il est important que cela soit fait proprement. Vous devriez être capable de voir clairement l&#39;embryon somites. Couper l&#39;embryon en deux, transversalement entre la buds.Now membres supérieurs et inférieurs couper le corps thoraciquemur à l&#39;aide des ciseaux de microdissection. </li></ol> 3. Préparation Slice embryon <ol><li> Retirer la solution d&#39;agarose du bain-marie. Couper 5 cm du fond du jetable 3 ml plastique pipette Pasteur. </li><li> Retirez délicatement la moitié lombaire de l&#39;embryon disséquée par deux pinces au berceau de l&#39;embryon de la solution de dissection et les placer dans un plat de Pétri sec. À l&#39;aide de la pipette Pasteur, supprimer l&#39;ordre de 2 ml d&#39;agarose, une pipette de 0,5 ml environ au-dessus de l&#39;embryon, puis aspirer la tranche embryon dans la pipette. Transfert de l&#39;embryon et de l&#39;agarose à une peau de moule en plastique de suite prendre soin de ne pas introduire de bulles dans l&#39;agarose. Abaisser doucement l&#39;embryon jusqu&#39;au fond de l&#39;agarose dans le moule en matière plastique avec la partie dorsale tournée vers le bas. L&#39;embryon doit être positionné à droite à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 21. Les tranches contiendra également partie du membre en développement et il est important que l&#39;orientation de l&#39;embryon dans la géloseose se permettre cela. Placez le bateau sur la glace pour régler le agarose. Veillez à ce que l&#39;embryon ne change pas d&#39;orientation au cours de cette période (environ 2 minutes). </li><li> Le Leica VT1000S vibratome (vitesse 3, Fréquence 4, 400 um d&#39;épaisseur) devrait être mis en place avec la chambre de tranchage rempli avec du HBSS et entouré par de l&#39;eau glacée. Le bloc d&#39;agarose est ensuite collé à la plate-forme vibratome avec de la super glue. Le bloc d&#39;agarose est garni d&#39;une lame de rasoir pour laisser l&#39;embryon pièce avec 1-3 mm d&#39;agarose qui l&#39;entoure. Les tranches qui comprennent des sections bourgeon de membre avec une claire apicale ectodermique Rigde sont sélectionnés et ces tranches sont ensuite placés dans HBSS. En général, il ya seulement un ou deux tranches appropriées par embryon. Retirez délicatement le agarose autour des tranches de tissu à l&#39;aide de deux aiguilles. Il est essentiel que cela soit fait soigneusement et complètement. </li></ol> 4. Tranches d&#39;embryons en culture <ol><li> Ajouter 500 ml de solution de culture (voir ci-dessus) à la requirnombre ed des puits d&#39;une 24-puits traitées fixation ultra basse plaque de culture tissulaire. Transférer les tranches soin de la solution HBSS dans le puits. En général, nous essayons d&#39;avoir deux à trois tranches dans chaque puits. Placer la plaque de 24 puits dans l&#39;incubateur de culture tissulaire à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 24 h. </li></ol> 5. Sectionnant les tranches d&#39;immunocoloration <ol><li> Après la période de culture, ajouter 500 ul de solution tamponnée à chaque puits de tranches d&#39;embryons et de laisser sur la glace pendant 20 min. La solution totale est ensuite retiré avec soin et trois lavages PBS sont réalisés, avec des intervalles de 5-min. Les tranches sont ensuite laissés dans une solution de saccharose à 4 ° C, jusqu&#39;à ce que le puits de tranches, environ 6 heures, mais peut être laissé plus longtemps (par exemple la nuit). </li><li> Retirez les tranches et tamponner une solution de saccharose supplémentaire et s&#39;équilibrer dans environ 1 octobre ml pour environ 5 min à 20 ° C. Montez chaque tranche plat dans un moule OCT-remplie décoller en plastique.Après le montage, placer les moules verticalement sur de la glace sèche se solidifier. </li><li> Monter les blocs octobre dans le cryostat et équilibrer les blocs à -24 ° C pendant environ 20 min. Couper chaque tranche de 15 mm montés sur les sections Superfrost-Plus diapositives. Les diapositives peuvent être conservés à -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 6. Immunofluorescence <ol><li> Pipette 1-2 ml de PBS sur les glissières horizontales tenues dans une chambre humidifiée avec les lames soulevées par le bas de la chambre (on utilise 1 ou 2 pipettes en plastique fixés ml avec du ruban autoclave). Incuber les sections dans du PBS pendant 5 min à 20 ° C pour enlever l&#39;excès octobre Retirer la solution de PBS à partir de la diapositive et ajouter 500 ml de solution de bloc sur les sections, incuber pendant 30 min à 20 ° C. Retirez le bloc de solution et ajouter immédiatement 500 ml de l&#39;anticorps primaire dilué ajoutées aux diapositives, incuber à 4 ° C pendant 18-22 heures. </li><li> Retirez solution d&#39;anticorps primaire et a été immédiatementh les lames avec 1 ml de PBS pendant 5 min, trois fois à 20 ° C pour éliminer l&#39;excès de solution d&#39;anticorps primaire. Ajouter 500 ml d&#39;anticorps secondaire dilué au cours des sections. Les lames sont ensuite laissé à 20 ° C pendant 30 min. La solution d&#39;anticorps secondaire est ensuite retiré et la diapositive lavées 3 fois 5 minutes dans du PBS à 20 ° C. </li><li> Après ces lavages, retirez la finale lavage PBS, tamponnez le bord de la lame pour enlever l&#39;excès de PBS, ajouter deux gouttes de Vectashield sur les toboggans et poser délicatement une lamelle de verre sur les sections, en évitant la formation de bulles. Enlever l&#39;excès de Vectashield blot à partir du bord avant des lames d&#39;imagerie. </li></ol> 7. Imagerie <ol><li> L&#39;image des sections immunocolorées. Nous utilisons un Nikon Eclipse E80i microscope à fluorescence équipé d&#39;une caméra numérique Hamammatsu ORCA ER et 10 X, 20X et 40 X lentilles d&#39;objectif. </li></ol>

<ol>
	<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+specification+in+the+spinal+cord:+Inductive+signals+and+transcriptional+codes.">Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes.</a> Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).</li><li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+Of+Motoneurons+Supplying+Chick+Hind+Limb+Muscles.">Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles.</a> Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).</li><li>Romanes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+motor+pools+of+the+spinal+cord.">The motor pools of the spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).</li><li>Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+repertoires+for+motor+neuron+diversity+and+connectivity+gated+by+a+single+accessory+factor,+FoxP1.">Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1.</a> Cell. 134 (2), 304-316 (2008).</li><li>Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+actions+of+the+forkhead+protein+Foxp1+and+Hox+proteins+in+the+columnar+organization+of+spinal+motor+neurons.">Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons.</a> Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor-neurons+defined+by+expression+of+limhomeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+roles+for+LIM+homeobox+genes+in+directing+the+dorsoventral+trajectory+of+motor+axons+in+the+vertebrate+limb.">Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb.</a> Cell. 102 (2), 161-173 (2000).</li><li>Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins.">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109 (2), 205-216 (2002).</li><li>Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Neuron+Position+and+Topographic+Order+Imposed+by+&#946;-+and+&#947;-Catenin+Activities.">Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by &#946;- and &#947;-Catenin Activities.</a> Cell. 147 (3), 641-652 (2011).</li><li>Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catenin-Dependent+Cadherin+Function+Drives+Divisional+Segregation+of+Spinal+Motor+Neurons.">Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).</li><li>Haase, G., Dessaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+acts+through+PEA3+to+regulate+cell+body+positioning+and+muscle+innervation+of+specific+motor+neuron+pools.">GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).</li><li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+slices.">Embryo slices.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).</li><li>Hotary, K. B., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+that+guide+sensory+and+motor+neurites+identified+in+an+embryo+slice+preparation.">Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation.</a> Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).</li><li>Krull, C. E., Tosney, K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+slices+and+strips:+Guidance+and+adhesion+assays+in+the+avian+embryo.">Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo.</a> Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. 87, 97-113 (2008).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+(Reprinted+From+Journal+Of+Morphology,+Vol.+88,+1951).">A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951).</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+progress+in+corticoneurogenesis:+From+silver+impregnation+to+genetic+engineering.">A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering.</a> Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).</li><li>Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+mediate+motor+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).</li><li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse.">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).</li><li>Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Live+Imaging+of+Cell+Behavior+in+the+Developing+Neuroepithelium.">High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium.</a> J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).</li><li>Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-7+and+cadherin-6B+differentially+regulate+the+growth,+branching+and+guidance+of+cranial+motor+axons.">Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons.</a> Development. 137 (5), 805-814 (2010).</li></ol>

Aucun des auteurs ont des intérêts ou conflits d&#39;intérêts.

Le protocole décrit ici permet une tranche d&#39;embryon de poulet pour être incubé pendant plus d&#39;un jour, tout en gardant les motoneurones en vie et continue de migrer pendant la période de culture. En élucidant les conditions pour maintenir en vie les neurones moteurs, nous avons identifié plusieurs éléments clés nécessaires. Il semble que le sérum de poulet jusqu&#39;à 4% est essentielle à la survie des neurones moteurs et son remplacement par du sérum provenant d&#39;une espèce différente ne sont pas tolérés. Fait intéressant, nous avons constaté que la présence de fortes concentrations de sérum ont été préjudiciables aux tranches comme ils promus prolifération du tissu entraînant des distorsions flagrantes en forme de tranche. Plus important encore, la présence du facteur neurotrophique ciliaire se sont avérées essentielles. Il reste une possibilité distincte que les tranches peuvent être en mesure d&#39;être cultivées pendant des périodes beaucoup plus que juste 24 heures, peut-être même permettant la visualisation des afférences sensorielles de la moelle épinière. En outre, la cultureconditions ture ici peuvent également se révéler utile pour trancher les cultures du tronc cérébral et le développement du cerveau moyen / cervelet. Peut-être le plus grand bénéfice potentiel de l&#39;utilisation de ces conditions de culture tranche est qu&#39;ils facilitent la possibilité pour la manipulation pharmacologique de la fonction des protéines tout en minimisant le risque d&#39;effets néfastes sur le reste de l&#39;embryon, comme le cœur. Un grand nombre d&#39;inhibiteurs et des agonistes de différentes voies de signalisation peuvent être utilisés pour évaluer la migration des neurones spinaux différents sous-types et, éventuellement, leur effet sur la formation de circuits locaux colonne vertébrale au cours du développement. En outre, certaines perturbations génétiques de l&#39;expression des protéines, comme ceux qui font usage de siRNA et des oligonucléotides morpholino, souffrent du fait qu&#39;ils ne peuvent être introduits au début du développement (en raison de limitations dans les procédures d&#39;électroporation in ovo) et les effets ne durent que un court laps de tem pse (généralement une journée). Notre culture tranche est lancée à un stade ultérieur et offre la possibilité d&#39;utiliser cette technologie tard dans le développement au stade de trancher pour voir leurs effets au cours de la période de la culture de la tranche. Le protocole de culture tranche pourrait également permettre la visualisation de la colonne vertébrale à la fois neurone moteur ainsi que la migration des interneurones dorsale en temps réel via vidéo-microscopie time-lapse. Ceci pourrait être réalisé en utilisant la microscopie à contraste de phase sous une lumière blanche ou par l&#39;utilisation de l&#39;imagerie de fluorescence. Si cette dernière technique devait être utilisé, alors l&#39;introduction de marqueurs fluorescents est nécessaire. Cela pourrait se faire soit par l&#39;introduction de colorants fluorescents tels que Dil ou DiO soit via marquage rétrograde de la branche ou de marquage antérograde du ventricule ou de l&#39;électroporation in ovo de constructions à conduire des protéines fluorescentes dans un sous-ensemble de neurones.

Au cours du développement normal de l&#39;embryon, de nombreux types de cellules différents sont générés qui doivent migrer à partir de leur point d&#39;origine à l&#39;endroit où ils finiront par fonctionner dans l&#39;organisme adulte. À l&#39;intérieur de la moelle épinière en développement, les cellules progénitrices sont situés dans la zone du ventricule à la ligne médiane et générer plusieurs sous-types de neurones et de cellules gliales postmitotiques qui doivent migrer à intégrer dans les circuits neuronaux fonctionnels nécessaires au traitement sensoriel et moteur 1 sorties. Motoneurones spinaux qui contrôlent la contraction des muscles des membres ont été largement étudiés et bien connu des molécules et les mécanismes qui sous-tendent la formation de leurs différentes sous-classes. Cependant, on sait beaucoup moins sur les mécanismes par lesquels les neurones moteurs migrent, séparer et recevoir des entrées synaptiques. L&#39;identité du moteur sous-type de neurone est acquise lors du développement d&#39;une manière hiérarchique. Sous-types de neurones moteurs peuvent être globalement classés icolonnes distinctes nto, les divisions et les piscines qui sont définis par leurs projections axonales. Moteur colonnes axones projet soit axiales, muscles viscéraux ou d&#39;un membre. Divisions automobiles subdiviser le membre projetant des motoneurones de la colonne latérale du moteur (LMC) en saillie vers ceux muscles ventraux ou dorsaux 2. Au sein des divisions, des groupes de neurones moteurs appelé moteur piscines projet de muscles individuels dans la branche 2, 3. Motoneurones orthopédique saillie sont définis par l&#39;expression du facteur de transcription FOXP1 4, 5, tandis que l&#39;identité de division est caractérisée par l&#39;expression des facteurs de transcription à homéodomaine Islet-1 (ventralement saillie) ou Lhx-1 (dorsalement en saillie) 6. En effet, Lhx-1 expression est nécessaire pour les projections appropriées dorsales des motoneurones 7. Chacun de ces sous-types distincts occupent des postes au sein de la moelle épinière; ventrales neurones moteurs en saillie viennent résider dedans dorsalement projecting neurones moteurs. Il en résulte la LMC étant séparés en soi-disant LMCmedial (LMCM) et LMClateral (PCIME) divisions. Organisation divisionnaire piscine et le moteur est acquis en deux phases 8. Dans la première phase, la ségrégation de la division est réalisée par une migration des neurones moteurs dans une caractéristique interne à la mode latéral. Les cellules PCIME sont générés après que les cellules LMCM etc PClME migre à travers le LMCM pour atteindre sa position de décantation finale. La deuxième phase se neurones moteurs dans une division et les clusters eux dans des pools de motoneurones, probablement par un tri dorso-ventral des neurones moteurs. Les membres de la famille caténine-dépendante cadhérine classique ont été montré pour être cruciale pour les deux phases de 8-10 moteur organisation des neurones. Cependant, la façon dont la fonction cadhérine contrôle le mouvement des cellules est mal comprise. L&#39;acquisition des identités colonnaire, de la division et de la piscine nécessite des signaux extrinsèques ce modèle intrinsèquementexpression c de 11 facteurs de transcription. En outre, environ 50% de l&#39;ensemble des motoneurones meurent par apoptose au cours du développement normal dans un processus qui nécessite des signaux extrinsèques de la branche, en grande partie grâce à l&#39;appui neurotrophique de survie des neurones moteurs. Ainsi, des neurones moteurs du développement nécessite un environnement approprié doit être maintenue à un timecourse relativement longue. Pour cette raison, les pratiques de production épinière cultures tranche cordon pour maintenir survie des neurones moteurs exigent l&#39;élucidation des conditions de culture appropriées. Précédent cultures tranche des embryons ont été utilisés pour suivre le comportement de extrinsèquement ajouté purifiée populations neuronales 12-14. Cependant, à nos conditions de culture connaissances qui facilitent in situ survie des neurones moteurs et la migration dans la tranche elle-même n&#39;ont pas été publiés. Nous avons modifié une condition de culture standard qui facilite la survie de purifier, dissociées des motoneurones crâniens afin de faciliter moteur neurone de développement au sein d&#39;un système de culture d&#39;embryons tranche. Nous avons aussi suivi le positionnement des motoneurones survivants et de démontrer que les positions normales grande partie de la division des neurones moteurs est acquis pendant la période de culture.

<table border="1"><tbody><tr><td> Œufs </td><td> Henry Stewart Farms, Royaume-Uni </td><td></td><td> Oeufs fécondés Brown Bovan Or poule (Henry Stewart Farms, Royaume-Uni), stockées à 14 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;incubation </td></tr><tr><td> Aiguille 21 Gauge </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 5 ml </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> N ° 5 Dumont pince </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Ciseaux à dissection </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3,5 à droite) </td></tr><tr><td> Moules d&#39;enrobage d&#39;embryons: Peel Away moules </td><td> Agar Scientific </td><td> G3764 </td><td> Forme pyramidale 22 mm à 12 mm </td></tr><tr><td> Super colle </td><td></td><td></td><td> Power Flex, Loctite </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Di-sodium hydrogénophosphate, un mono-hydrate </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Sodium di-hydrogène phosphate mono </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Basse température de fusion d&#39;agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxyde de sodium </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Plastique jetables pipettes Pasteur </td><td> Elkay précision consommables de laboratoire </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 Volume ml </td></tr><tr><td> Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Carbonate acide de sodium </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Extrait d&#39;embryon de poulet </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine solution </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine solution </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Sud Labs Groupe </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Milieu Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur CilliaryNeurotrophic (CNTF) </td><td> R et D Systems </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poussin Sérum </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Les anticorps primaires </td><td></td><td></td><td> ont été achetés auprès de la Banque de développement d&#39;hybridomes études, à l&#39;exception des anticorps anti-FOXP1, qui étaient un cadeau aimable de Bennett Novitch de l&#39;UCLA. Primaires dilutions d&#39;anticorps étaient de lapin anti-FOXP1 (1/32000), Souris anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), la Guinée Pig anti-FOXP1 (1/1000). Tous les anticorps ont été conservés à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorps secondaires </td><td></td><td></td><td> Âne anti-Guinée Pig (cy3) (1:1000) achetés auprès de Jackson Laboratories Immunoreseach âne anti-souris Inc (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-lapin (Alexa Fluor 594) (1:1000) achetés chez Invitrogen Tous les anticorps ont été conservés à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Plaque de 24 puits </td><td> Corning Costar </td><td> 3473 </td><td> attachement ultra plaque de 24 puits </td></tr><tr><td> Octobre </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Température de coupe optimale </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield fluorescente montage support </td></tr><tr><td> Diapositives </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> Superfrost-Plus diapositives chargées positivement, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Couvercle en verre </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 mm </td></tr><tr><td> Tirage forcé incubateur: </td><td> Lyon Electric Company </td><td></td><td> maintenue humide en assurant des niveaux d&#39;eau suffisants, toujours maintenu à 38 ° C </td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Brite, Huntingdon, Royaume-Uni </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubateur </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C CO, 5% 2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i microscope à fluorescence </td></tr><tr><td> Appareil photo numérique </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M et Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice culture protocol

Trancher les cultures peuvent faciliter la manipulation du développement de l&#39;embryon à la fois pharmacologique et par des manipulations génétiques. Dans ce système réduit, les effets secondaires potentiellement mortels dus à des applications systémiques des médicaments peuvent être surmontés. Cependant, les conditions de culture doivent s&#39;assurer que les produits normaux de développement au sein de l&#39;environnement réduit de la tranche. Nous nous sommes concentrés sur le développement de la moelle épinière, en particulier celle des motoneurones spinaux. Nous varier systématiquement les conditions de culture des embryons de poulet tranches à partir du moment où les motoneurones spinaux plus était née. Nous avons mesuré le nombre et le type des neurones moteurs qui ont survécu pendant la période de la culture et de la position de ces neurones moteurs par rapport à celle in vivo. Nous avons constaté que le sérum et le type de facteurs neurotrophiques ont été tenus au cours de la période de culture et ont réussi à maintenir en vie les neurones moteurs pendant au moins 24 heures et permettre à ces neurones moteurs de migrer vers des positions appropriées dans lemoelle épinière. Nous présentons ces conditions de culture et la méthodologie de préparation des cultures tranche d&#39;embryons utilisant des embryons de poulet éviscéré intégrés dans d&#39;agarose et coupées en tranches à l&#39;aide d&#39;un vibratome.

L&#39;utilisation de tranches d&#39;élevage afin de suivre le développement des neurones et des interneurones de projection a eu une influence sur notre compréhension progresse de la génération d&#39;organisation au sein du cortex 16. Dans la moelle épinière, des neurones moteurs du développement a été suivi en utilisant des cultures de embryons de poisson zèbre au total 17. Toutefois, la colonne vertébrale du motoneurone organisation chez le poisson zèbre est relativement simple (en raison de l&#39;absence des muscles des membres importants chez les poissons). Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent une hiérarchie de la colonne vertébrale du motoneurone organisation au cours du développement des vertébrés supérieurs sont actuellement mal compris. Les conditions de culture qui favorisent la survie des neurones et la migration corps cellulaire dans les cultures tranche d&#39;embryons de vertébrés supérieurs sont donc nécessaires. Actuellement, la colonne vertébrale cultures tranche moelle des vertébrés supérieurs ont été utilisés pour les neurones dissociés de semences sur le dessus de 12-14 tranches, d&#39;enquêter sur les axones marqués par fluorescence dans la périphérie de la tranche18, ou du comportement de cellules souches dans le développement précoce du cordon médullaire 19. Trancher les conditions de culture pour les cordons médullaires plus tard, en particulier ceux qui maintiennent des neurones moteurs du développement font actuellement défaut. Pour tenter de suivre la colonne vertébrale du développement neuronal, en particulier celui des neurones moteurs spinaux, nous avons étudié diverses conditions de culture qui pourraient favoriser la survie des neurones moteurs et l&#39;acquisition de la commande initiale dans l&#39;organisation du moteur grâce à la migration latérale des neurones. Les premiers essais utilisant l&#39;étape 18 à l&#39;étape 20 tranches de poulet embryonnaires de la moelle épinière révélées infructueuses, nous n&#39;étions pas en mesure de garder en vie les neurones moteurs pendant plus de quelques heures et ont été incapables de démontrer la production d&#39;un nombre important de cellules PCIME au cours de la période de culture (données non représenté). Nous avons donc étudié les cultures tranche de l&#39;étape 24 embryons, un point de temps où la majorité des PClME et les neurones LMCM ont été générés, mais quand PClME neurone migration est encore à ses infancy (Figure 1a-c). Cette migration latérale des neurones PCIME est en grande partie achevée par étage 27, de 24 à 36 heures plus tard (Figure 1 ddl). Notre test pourrait donc être simplifiée pour être capable de garder les neurones en vie et pour faciliter leur migration latéralement dans la corne ventrale. Nous avons commencé nos expériences avec des conditions de culture relativement simples contenant une solution juste saline équilibrée de Hank avec ou sans sérum de poulet ou extrait d&#39;embryon de poulet. Dans tous les cas, même si nous étions en mesure de maintenir les neurones LMC dans la tranche, nous avons trouvé peu de preuves de neurones PCIME est maintenue (au moins par l&#39;expression de Lhx-1). En outre, nous avons trouvé l&#39;expression inappropriée de gènes tels que HB9 dans la moelle épinière dorsale, une situation qui ne se produit in vivo (données non présentées). Ainsi, ces conditions de culture simples ne sont pas adaptés pour l&#39;étude de l&#39;acquisition des motoneurones organisation. Nous avons donc cherché à conditio plus complexens et comme base utilisé une formulation qui a été publié afin de faciliter la survie des neurones embryonnaires de poulet dissociées moteurs crâniens. Cette condition 20 (1% d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet, plume 1% Strep, 0,35% de L-glutamine, 0,1% de 2-mercaptoéthanol, sérum de cheval à 2%, 2% B27 supplément et 50 ng / ml de facteur de croissance ciliaryneurotrophic (CNTF) dans un milieu neurobasal (appelé ici Guthrie moyenne) ne garder neurones moteurs plus vivants que les médias les plus simples. De plus, il n&#39;a pas donné lieu à l&#39;expression fallacieuse de facteurs de transcription dans la moelle épinière dorsale. Cependant, la survie des neurones PCIME était pauvre (figure 1 gi, p). Nous avons donc varié ce que nous considérons être des facteurs clés dans le milieu de Guthrie, à savoir l&#39;animal d&#39;origine du sérum, la concentration du sérum et la concentration de CNTF dans le milieu. Nous avons trouvé que la modification du sérum de sérum de cheval poussin de sérum et une augmentation de la concentration de CNTF de 50 ng / ml à 100 ng / ml sensiblement augmenté til la survie des cellules PCIME et LMCM et a aussi permis leur migration dans la corne ventrale plus de 24 h des conditions de culture (figure 1 jl, p). Le nombre total de neurones moteurs, le rapport de LMCM de PCIME et, en effet, la migration des cellules PCIME dans la corne ventrale est apparu très similaires aux sections d&#39;embryons qui avaient été autorisés à se développer dans ovo plutôt que dans la culture tranche (Figure 1 ko, p). Ainsi, nous croyons que, d&#39;après l&#39;expression du facteur de transcription nombre de cellules, et la position des neurones moteurs, nos conditions de culture normales tranche récapituler moteur spinal développement des neurones au moins sur une période de 24 heures. <img alt="Figure 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figure 1. a - c. Statut de la génération de LMC (FOXP1 coloration dansb) et PClME (Lhx-1 dans une coloration) au stade 24. c est une opération de fusion des deux canaux. La ligne médiane est représentée par une ligne en pointillés et en D, V montre l&#39;orientation de la dorso-ventrale (D, V) axe de la moelle épinière. D - f. . Statut de LMC (FOXP1 coloration en d) et PClME (Lhx-1 coloration en e) l&#39;organisation au stade 27 f est une fusion des deux canaux g -. I. Lhx-1 (g) et FOXP1 (h) l&#39;expression dans les sections d&#39;une tranche cultivées dans un milieu qui favorise la survie crânienne de cellules neurones moteurs (moyen Guthrie, notre «milieu initial» voir référence 20). Lhx-1 n&#39;est plus exprimée dans les neurones moteurs, bien qu&#39;il y ait survie des cellules de LMC en évidence par FOXP1 expression. D, V (g) indique l&#39;orientation de la dorsoventral (D, V) de l&#39;axe de la moelle épinière. ML montre l&#39;orientation de la médio-latérale (M, L) axe de la sj cordon Pinal - l. Cellules PCIME (Lhx-1 dans la corne ventrale en j) et la LMC en général (FOXP1 en k) peut être observée en tranches cultivées dans un milieu contenant 4% de poulet sérum et 100 ng / ml CNTF. Notez que certaines cellules PClME se trouvent dans une position latérale dans la corne ventrale. La flèche en (j) représente la position latérale d&#39;une partie des cellules des PClME. (L) est une opération de fusion des deux canaux m -. O. Statut d&#39;expression de Lhx-1 (m) et FOXP1 (n) dans des sections d&#39;un embryon in ovo maintenu au cours de la culture de section de l&#39;embryon représenté sur la j - l. (O) est une opération de fusion des deux canaux. P. La quantification du pourcentage de PCIME (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve) contre les cellules LMC (FOXP1 + ve / Lhx1-ve) cellules présentes dans les cultures tranche dans des conditions différentes compared pour contrôler les embryons conservés in ovo (qui représentent 100%). Test t de Student *** représente p &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol at JoVE.com

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Trancher les cultures de faciliter la manipulation du développement embryonnaire par le gène et les perturbations pharmacologiques. Toutefois, les conditions de culture doivent veiller à ce que le développement normal de procéder à l&#39;intérieur de l&#39;environnement réduit de la tranche. Nous illustrons un protocole qui facilite le développement normal de la moelle épinière se poursuivre pendant au moins 24 heures.

Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.9K vues.  University College London. Trancher les cultures de faciliter la manipulation du développement embryonnaire par le gène et les perturbations pharmacologiques. Toutefois, les conditions de culture doivent veiller à ce que le développement normal de procéder à l'intérieur de l'environnement réduit de la tranche. Nous illustrons un protocole qui facilite le développement normal de la moelle épinière se poursuivre pendant au moins 24 heures.

Vidéo: Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Une unité fonctionnelle du moteur dans la boîte de culture: La co-culture d&#39;explants de la moelle épinière et les cellules musculaires

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

L&#39;isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique eliminates laminectomy by removing two spinous processes and lifting, then tilting the caudal vertebral arch. The surgical area opens up without the need for laminectomy. Lateral hemisection is then performed with direct visible control under a microscope. The trauma is minimized, requiring only a small bone wound. 
This technique has several advantages: it is faster and, therefore, less of a burden for the animal, and the bone wound is smaller. Because the laminectomy is eliminated, there is less chance for unwanted injury to the spinal cord, and there are no bone splinters that can cause problems (bone splinters embedded in the spinal cord can cause swelling and secondary damage). The vertebral canal remains intact. The main limitation is that the hemisection can only be performed in the intervertebral spaces. 
The results show that this technique can be performed much faster than the traditional surgical approach, using laminectomy (11 min vs. 35 min). This technique can be useful for researchers working with animal models of open spinal cord injury as it is widely adaptable and does not require any additional specialized instrumentation.

Here, we describe a new, fast technique modeling open spinal cord injury in rats that eliminates laminectomy. Lateral hemisection is performed while viewing through a microscope. The technique is versatile and can also be used in the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spinal cord of other animals.

Une technique d’hémisection latérale rapide et mini-invasive de la moelle épinière pour modéliser les lésions ouvertes de la moelle épinière chez le rat

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...