Ce travail a été soutenu par des subventions R01-HL87290, R01-HL87290-S1 et R01-AI082610 du National Institutes of Health aux LJMC.

1. Craniotomie Une craniotomie en 8 à 10 semaines des souris âgées doit être effectuée à l&#39;avance comme une décrits précédemment, sauf que la barre de titane n&#39;est pas placé à la tête de l&#39;animal. La fenêtre chroniques crânienne est un examen permettant préparation stable de la microcirculation piales voire des mois après son implantation. Habituellement, nous effectuons nos études 2-3 semaines après l&#39;implantation fenêtre crânienne. 2. Microscopie intravitale <ol><li> Deux-trois semaines après la craniotomie, la température du corps est cochée, puis la souris est légèrement anesthésiés à l&#39;isoflurane (4% pour l&#39;induction, de 1-2% pour la maintenance). Anesthésie légère est utilisée pour prévenir le stress des animaux et de l&#39;inconfort lors de la procédure expérimentale. </li><li> Les animaux sont ensuite placés en décubitus ventral sur un cadre stéréotaxique et la tête soigneusement sécurisés utilisant les barres d&#39;oreille. Le niveau est ajusté en utilisant les leviers de droite et de gauche. Température centrale du corps est maintenue à l&#39;aide d&#39;un coussin chauffant. Parce que les souris avec le paludisme cérébral de développer l&#39;hypothermie, les paramètres de température doivent être ajustés pour chaque animal. </li><li> La lamelle sur la fenêtre crânienne est légèrement nettoyé avec un coton-tige humidifié avec de l&#39;huile minérale et une image panoramique sur les vaisseaux sous la fenêtre est pris avec l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope et d&#39;un appareil photo numérique (Nikon Coolpix 995, Japon). La photo est imprimée, identifié et daté et sera utilisée comme une carte pour les mesures de diamètre du vaisseau et de globules rouges (RBC) vitesses. </li><li> La souris est alors transféré à une platine de microscope intravitale (personnalisés Leica-McBain, San Diego, Californie). Une goutte d&#39;eau est placée sur la fenêtre crânienne profitant du puits formé par les acryliques dentaires, l&#39;accent est ajustée. Les mesures sont effectuées en utilisant un objectif de l&#39;eau 20X (LUMPFL-WIR, ouverture numérique 0,6, Olympus) d&#39;immersion. Les mêmes navires sont suivis afin que les comparaisons directes à leur niveau de référence pourrait être effectuée permettant plus de statistiques robustes pour les populations petit échantillon. Les images sont capturées en utilisant un appareil photo numérique à faible vitesse de la lumière élevée (Hamamatsu C9300-221, Japon), ou à faible lumière caméra analogique (COHU 4815, San Diego, Californie) relié à une bande de magnétoscope (JVC, Japon), horodatés (Vidéo Microimage Systèmes, Boyertown, PA) et un écran couleur (Pelco, Clovis, Californie). Le ruban est correctement identifié avant le début de l&#39;enregistrement, et l&#39;horodatage permet d&#39;identifier les événements en documentant la période pendant laquelle ces événements ont été recodé. </li><li> Une première vérification des vaisseaux est fait pour évaluer la qualité de la préparation et si le sang coule dans toutes les cuves. Ensuite, la sélection des navires devant être mesurée est faite et il devrait inclure des veinules et des artérioles de différents diamètres (dans nos préparatifs de souris piales, la plupart des navires varie entre 20 et 80μm) et couvrent différents endroits dans la zone exposée par la fenêtre. Artérioles et veinules peuvent être facilement différenciés par la vérification du sens du flux sanguin dans les ramifications de la cuve (si elle distribue ou collecte de sang). Dans nos études, les mesures sont effectuées dans les 12 navires. Repérage précis de chaque spot à mesurer est annoté dans le tableau de la vascularisation piales. </li><li> Pour chaque spot, le diamètre du vaisseau est mesuré en utilisant un dispositif de cisaillement d&#39;image (image de cisaillement, Vista Electronics, San Diego, CA) 2. Une fois que le spot est sélectionné, l&#39;image du navire est aligné en position verticale et l&#39;image est cisaillé jusqu&#39;à des extrêmes opposés sont alignés et la lecture est documentée. Cette valeur peut être traduit en micromètres par étalonnage précédente pour chaque grossissement spécifique en utilisant un micromètre étalonnage Réticule scène (Edmund Optics Inc, Barrington, NJ). </li><li> Chaque spot est enregistrée pendant 30 secondes au moins pour le suivi des érythrocytes. Pour le suivi, sur un échantillon de sang est prélevé, et les érythrocytes sont marqués par fluorescence avec le colorant carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) et perfusée à travers la veine de la queue pour obtenir une concentration en vivo de ~ 0,4-0,5% 3. Chez les animaux infectés par Plasmodium berghei ANKA (PBA), exprimant la protéine fluorescente verte (GFP PBA-, un don de la recherche sur le paludisme et la référence réactif Centre de ressources MR4, Manassas, en Virginie, déposé par CJ Janse et AP-Eaux), pas de perfusion d&#39;étiquette cellulaire est nécessaire. Les images vidéo sont enregistrées à 150 images par seconde. Ce taux est fixé pour obtenir un six images d&#39;une cellule sur une image vidéo pour la détermination des vitesses allant jusqu&#39;à 8 mm / s. Les images vidéo sont numérisés avec un ordinateur personnel en utilisant Adobe Premier 4.0 du logiciel, et xy données de coordonnées pour chaque image de cellules sont obtenues en utilisant le logiciel Pro 4.0 SigmaScan (SPSS Chicago, IL) 4. Positions cellulaire sont déterminés manuellement plutôt que par analyse d&#39;image, étant donné que l&#39;œil d&#39;un observateur qualifié a été montré pour donner une bonne estimation de l&#39;emplacement du centre d&#39;une cellule, ce quih en général correspond à l&#39;emplacement de la fluorescence maximale observée pour les orientations les plus cellulaires. Déterminations multiples de la position et la vitesse sont faites pour chaque cellule et moyenne afin d&#39;obtenir la vitesse moyenne de RBC. </li><li> Lorsque des mesures de vitesse sont effectués hors de RBC, le temps total d&#39;observation pour chaque souris ne dépasse pas 10-15 minutes en minimisant les effets cardiodépresseur de l&#39;anesthésie. </li><li> Une fois le diamètre du vaisseau et les mesures de vitesse RBC sont disponibles, le calcul du débit sanguin dans chaque navire peut être faite en utilisant la formule suivante: Q = V x π (D / 2) 2, où Q = le débit sanguin, V = vitesse de RBC et D = diamètre du vaisseau. </li><li> Ces procédures peuvent être répétées dans le temps. Par exemple, dans le modèle murin de neuropaludisme, nous effectuons des mesures quotidiennes à partir du jour 4 de l&#39;infection. Les valeurs obtenues chaque jour pour chaque souris sont normalisés par rapport au jour 0 (pré-infection), qui est considéré être à 100%. </li><li> En plus de diamètre du vaisseau et les mesures du flux sanguin, des évaluations supplémentaires peuvent être effectuées, par exemple pour l&#39;évaluation de l&#39;amélioration de la perfusion et l&#39;analyse des leucocytes roulant et / ou de plaquettes et l&#39;adhérence dans les vaisseaux pie-mère. Ces mesures sont effectuées avec l&#39;aide de marqueurs fluorescents marqués. Dans le cas du paludisme, nous pouvons également détecter ou de parasites circulant adhérentes par des moyens d&#39;utiliser la souche PbA qui exprime la GFP. </li><li> Pour l&#39;évaluation de la perfusion, nous utilisons une solution de FITC-albumine marquée (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), et de quantifier l&#39;adhérence des leucocytes aux navires piales nous utilisons des anticorps contre les marqueurs pan-leucocytaire CD45 marqués avec Texas Red (TxR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Pour cela, 25 pi de l&#39;albumine-FITC (2mg/mL) et 20 pi de l&#39;anticorps anti-CD45-PE (200μg/mL) sont mélangés et injectés dans la veine de la queue préchauffé. La souris peut alors être visualisé immédiatement, toutefois, si des mesures de fuite se albumine-FITC est autorisé à circuler pendant 15 minutes. Fluorescence verte (518nm) émise par l&#39;albumine-FITC et GFP (PBA-GFP CGR) est capturé à l&#39;aide et ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), et anti-CD45-TxR fluorescence (615nm) est sorti et capturées avec une norme Vivid: XF42. </li><li> L&#39;albumine marqués par fluorescence permet une meilleure visualisation du réseau vasculaire, y compris les navires pénétrant, et il est particulièrement utile dans les états pathologiques tels que le paludisme cérébral pour vérifier pour les navires non perfusé ou sous-perfusées. Il peut également être utilisé pour mesurer les fuites vasculaires 5. </li><li> La fluorescence des anticorps anti-CD45 rendent facile à identifier et à quantifier l&#39;adhérence des leucocytes et des roulants à des navires piales. Pour éviter les biais dans la quantification, nous quantifions roulant et l&#39;adhérence dans les mêmes endroits pré-définis pour mesurer le flux sanguin. Quantification de l&#39;adhésion des leucocytes est faite par le comptage du nombre de leucocytes dans une longueur 100 microns-navire. Rolling est quantifiée par comptage du nombre de leucocytes circulant à une vitesse nettement plus lente que la vitesse du sang dans la même longueur 100 microns, pendant 30 secondes. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. (Étape 2.6) Photos du réseau vasculaire de la souris piales accessibles via la fenêtre crânienne. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. (Étapes 3.1 à 3.5) affichent schématique de la mise en place pour la microscopie intravitale de la microcirculation souris piales. 1: Microscope intravitale; 2: 20X objectif à immersion d&#39;eau; 3: source de lumière; 4a: numériques de faible éclairage caméra à grande vitesse; 4b: caméra analogique; 5: la souris dans le cadre stéréotaxique; 6: écran d&#39;ordinateur; 7: analogiques Shearer suivre en montrant comment l&#39;image de cisaillement (flèche) est fait pour mesurer le diamètre du vaisseau. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. (Étape 3.6 à 3.8) microvasculaire rouges mesures globules vitesse par la cellule de suivi à partir d&#39;enregistrements vidéo haute vitesse de fluorescence. Photos de A à F sont des images séquence d&#39;un navire de piales, montrant un seul mouvement RBC traversant le champ délimité par la caméra microscopique. Détermination manuelle du cadre par des positions cadre de 15 ou plus de cellules traversant le terrain, avec sa distance pré-calibré, permet le calcul de RBC vitesse moyenne dans chaque récipient à l&#39;aide d&#39;un tableur Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. (Étape 3.9) Les données d&#39;une expérience représentative montrant les modifications du débit sanguin dans le temps piales Plasmodium berghei ANKA (PBA) des souris infectées (n = 5) et chez les souris témoins non infectés (n = 5). Alors que chez les souris de contrôle de la circulation sanguine pial est relativement stable au fil du temps, la LRR souris infectées montrent une nette diminution du débit sanguinau moment du développement de la malaria cérébrale (jour 6). Les données sont la moyenne ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. (Étape 4.3) Un grand nombre de leucocytes adhérents aux navires piales de souris infectées par Plasmodium berghei ANKA, tel que révélé par coloration avec des anticorps anti-CD45-Rouge-Texas fluorescentes.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

La méthode décrite ici microscopie intravitale fournit un outil unique et puissant pour l&#39;observation détaillée de la microcirculation piales chez la souris. Il permet singulariser artérioles et veinules individuels et de mesurer les changements d&#39;un certain nombre de paramètres tels que diamètre des vaisseaux, des vitesses de RBC, le flux sanguin, l&#39;adhérence et le laminage des leucocytes, des plaquettes et d&#39;autres éléments du sang, des fuites vasculaires, le pH et pO2 tissus et potentielleme...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

Ce modèle expérimental a été conçu pour évaluer la microcirculation souris piales cours aiguës et chroniques, hémodynamiques physiologiques et physiopathologiques, maladies inflammatoires et métaboliques, à l&#39;aide de la microscopie par fluorescence in vivo. Une fenêtre fermée crânienne est placé sur la gauche du cortex pariéto-occipitale de la souris. Microcirculation locale est enregistrée en temps réel à travers la fenêtre en utilisant le PEV et d&#39;illumination par fluorescence, et des mesures de diamètres des navires et des globules rouges (GR) les vitesses sont effectuées. Vitesse de RBC est mesurée à l&#39;aide en temps réel de corrélation croisée et / ou érythrocytes marqués par fluorescence. L&#39;adhésion leucocytaire et plaquettaire aux navires piales et l&#39;évaluation de la perfusion et les fuites vasculaires sont faites avec l&#39;aide de marqueurs marqué par fluorescence tels que les anticorps d&#39;albumine-FITC et anti-CD45-TXR. Microcirculation peut être à plusieurs reprises enregistrées sur vidéo pendant plusieurs jours. Nous avons utilisé pour la première fois la microscopie intravitale fermer la fenêtre du cerveau pour étudier la microcirculation piales de suivre les changements dynamiques au cours de Plasmodium berghei ANKA l&#39;infection chez la souris et montrent que l&#39;expression de la CM est associée à des dysfonctionnements microcirculatoires caractérisé par une vasoconstriction, une diminution profonde dans le sang de flux et de l&#39;effondrement à terme vasculaires.

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Microscopie intravitale à suivre spatiale et temporelle des événements hémodynamiques et inflammatoires dans la microcirculation piales.

Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K vues.  University of California, San Diego. Microscopie intravitale à suivre spatiale et temporelle des événements hémodynamiques et inflammatoires dans la microcirculation piales.

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An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Une plate-forme expérimentale pour étudier les performances en boucle fermée des interfaces cerveau-machine

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Recherche

Neurosciences

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopie multiphotonique de cerveau de souris Effacé Exprimant YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formation extinction pendant la fenêtre Reconsolidation empêche la récupération de la peur

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Une méthode d&#39;infliger Fermé chef Traumatic Brain Injury dans<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

Piezo haute précision ablation chirurgicale osseuse (PHASOR) : Une Technique pour la chirurgie de la meilleure fenêtre crânienne chez les souris

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...