Le protocole décrit comment effectuer des injections virales et implanter une fenêtre crânienne pour l’imagerie des cellules cérébrales chez des souris éveillées et retenues par la tête. L’avantage de cette méthode est que la structure et l’activité des neurones et des astrocytes peuvent être imagées à plusieurs reprises sur plusieurs séances. Cette approche peut être utilisée pour déterminer comment les cellules neurales sont modifiées dans des modèles de troubles neurodéveloppementaux ou neurodégénératifs, ou si la plasticité dépendante de l’expérience est altérée.
Commencez par fixer une souris anesthésiée à un cadre stéréotaxique à l’aide de la pince à museau et des barres d’oreille. À l’aide d’outils chirurgicaux stériles, coupez et retirez la peau des sutures frontales antérieures au bregma à postérieurement au lambda. À l’aide d’une lame chirurgicale stérile en acier au carbone de taille 11, grattez doucement tout le tissu conjonctif du crâne.
À l’aide d’une perceuse dentaire, percez progressivement l’os du crâne le long du contour de l’ouverture en cercles concentriques pour faciliter l’amincissement uniforme de l’os. Après chaque passage concentrique, ajoutez une goutte ou deux de solution saline à la zone forée et laissez la solution saline reposer pendant au moins 10 secondes avant de reprendre le forage. Appuyez doucement sur la zone centrale de l’os du crâne avec une pince fine pour vérifier que le crâne est correctement aminci et bouge.
Assurez-vous que le système vasculaire sous-jacent où le forage a eu lieu est intact et que l’os n’est pas fissuré. Insérez soigneusement une lame pointue miniature à 15 degrés dans l’os aminci et coupez et utilisez la mousse de gel imbibée de solution saline pour arrêter tout saignement qui pourrait survenir. À l’aide de pinces, soulevez et retirez soigneusement l’os, en prenant soin de ne pas endommager la dure-mère.
Pour l’injection, remplissez une pipette en verre biseauté stérile avec une pointe de 20 micromètres avec le mélange de virus. Ensuite, abaissez la pipette pour toucher la surface du cerveau et continuez à baisser pendant 200 à 300 micromètres supplémentaires pour les injections de couche 2/3. À l’aide d’un système de distribution de micro-injection intracellulaire, injectez de la pression dans le système 12 à 15 fois en deux minutes.
Pour l’implantation de la fenêtre crânienne, placez le verre de couverture sur l’ouverture dans le crâne. Utilisez des pinces pour vous assurer que le verre est au ras de l’ouverture. Pour sceller les bords de la fenêtre en verre au crâne, appliquez un gel adhésif cyanoacrylate autour du périmètre de la surface du verre.
Sur le gel adhésif, appliquez une couche de colle. Ajoutez ensuite une couche de liquide de ciment dentaire. Lorsque le ciment dentaire durcit, appliquez une fine couche de colle autour de l’ouverture centrale de la plaque de tête de type hélicoptère et placez la plaque de tête de type hélicoptère de la taille appropriée sur le verre de couverture.
Laissez sécher la colle. Ajouter la poudre de ciment dentaire dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre jusqu’à la marque de 0,1 millilitre. Mélangez sept à huit gouttes d’adhésif instantané à durcissement rapide dans la poudre et aspirez le mélange résultant dans une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 19 qui a été coupée pour créer une plus grande ouverture.
Injecter le mélange de poudre à travers les trous latéraux de la barre d’hélicoptère jusqu’à ce qu’il s’infiltre de chaque côté. Appliquez le mélange adhésif de ciment dentaire sur le reste du crâne exposé pour fixer la plaque de tête au crâne. Enveloppez la souris dans un chiffon et fixez-la via sa plaque de tête au bras de fixation de la tête de la cage domestique transportée par avion, puis laissez la cage domestique exposée à la lumière.
Après un temps d’accoutumance de 15 minutes, retirez la souris de la cage de la maison. En utilisant le mode grand champ du microscope, sélectionnez deux à trois positions de vascularisation facilement identifiable. Enregistrez les images des vaisseaux sanguins et enregistrez les coordonnées x et y qui apparaissent sur le contrôleur du moteur.
Imagez les structures synaptiques des neurones et l’activité de GCaMP6f dans les astrocytes. Dans l’analyse représentative, la qualité de la fenêtre crânienne a été évaluée avec une imagerie répétée des dendrites et des astrocytes exprimant GCaMP6f au fil des jours. Dans une bonne fenêtre, les structures neuronales semblaient nettes avec des épines dendritiques clairement visibles.
Deux nouvelles épines sont apparues le deuxième jour de l’imagerie. Une seule colonne vertébrale a persisté et était visible le cinquième jour. L’activité calcique a été étudiée dans les astrocytes exprimant GCaMP6f à différents moments.
Un événement mondial englobant toute la cellule a été observé lors d’un combat de locomotion. Les deux étapes critiques de ce protocole sont que l’os doit être correctement aminci avant le retrait de l’os et le placement approprié du verre de couverture sur l’ouverture. L’imagerie peut être combinée à l’analyse comportementale, soit pendant l’imagerie, soit après le comportement, comme l’apprentissage d’une nouvelle habileté motrice, pour déterminer comment la structure et la fonction neuronales et astrocytaires sont modulées par l’apprentissage.
