Cette recherche a été financée en partie par les Instituts nationaux de la santé, accorder R01 EB007594, le ministère de la Défense du sein Le cancer du Programme de recherche, proposition BCO74699P7, et la Fondation Susan G. Komen octroi 26152/98188972.

1. Assemblée Microendoscope Le microendoscope haute résolution décrit ici (figure 1a) devrait être considéré comme une configuration de base avec plusieurs variations possibles dans l&#39;assemblage et l&#39;application. Nous décrivons en détail ici une réalisation de la plate-forme qui est conçu pour être utilisé avec proflavine comme agent de contraste fluorescents. Proflavine est une brillante tache avec nucléaires pic d&#39;absorption et d&#39;émission de longueurs d&#39;onde de 445 nm et 515 nm, respectivement. L&#39;utilisation d&#39;agents de contraste d&#39;autres auront besoin de l&#39;utilisateur de sélectionner l&#39;excitation, d&#39;émission, et des filtres dichroïques de manière appropriée. Plusieurs éléments de l&#39;microendoscope haute résolution sont génériques et peuvent être obtenus auprès de plusieurs fournisseurs. Par exemple, les composants opto-mécaniques de positionnement sont disponibles à partir Thorlabs, Newport, Linos, entre autres. Compact caméras CCD sont disponibles auprès de sociétés telles que Point Grey Research, Prosilica, et Retiga; sensibilité de la caméra doit être choisi en tenant compte de la luminosité du fluorophore à être utilisé, ainsi que la cadence désirée. Haute puissance des diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être obtenus à partir de Luxeon, des Cris et Nichia, entre autres. Fibre optique faisceaux sont disponibles auprès de Sumitomo, Fujikura, et Schott. Dans la sélection des composants pour une application spécifique, l&#39;utilisateur devrait considérer les relations inhérentes à la microscopie par fluorescence entre la concentration de fluorophore, photoblanchiment, intensité de l&#39;illumination, sensibilité de la caméra, le gain et le temps d&#39;exposition. <ol><li> Branchez le 6 &quot;tiges cage pour les 1,5&quot; tiges cage, pour former une paire de 7.5 &quot;de longues tiges. Vissez ces tiges dans une face de l&#39;unité de miroir pli. Visser le 0,5&quot; tiges dans la face opposée. Faites glisser le cube cage sur les tiges de la cage, en passant par les deux inférieurs à travers les trous. Vissez les deux &quot;tiges dans la face latérale du cube cage (figure 1b). </li><li> Fixez la caméra sur une plaque de la cage en utilisant une monture C à l&#39;adaptateur SM1. Fixez la plaque sur la cage de 0,5 tiges cage », affleure la face de l&#39;unité de miroir pli. </li><li> Insérez le «tube» dans une lentille de 3 &quot;lentille de tube long et sécuriser l&#39;objectif avec une bague de retenue. La longueur focale de l&#39;objectif doit être choisie de telle sorte que les noyaux du faisceau de fibres optiques sont échantillonnés par au moins deux pixels lors de la projection sur la caméra. Déposer le filtre d&#39;émission dans le tube au-dessus du premier anneau de retenue et ajouter une autre bague pour fixer le filtre en place. Respectez la convention d&#39;orientation du filtre indiqué par le fabricant du filtre. Vissez la lentille de tube sur le côté de la cube de la cage la plus proche de la caméra CCD. Notez que dans la figure 1c, cette lentille et le filtre sont présentés sans le tube 3 lentilles &quot;pour plus de clarté. </li><li> Connectez l&#39;appareil à un ordinateur et afficher l&#39;image sur l&#39;écran. Diriger l&#39;ensemble cage à un objet lointain et faites glisser le cube en cage le long des rails jusqu&#39;à une image apparaît au point. Verrouiller le cube en cage à cet endroit. (Ceci est une méthode simple de s&#39;assurer que la lentille de tube forment une image focalisée lorsqu&#39;il est combiné avec l&#39;infini-corrigés objectif). </li><li> Insérez le miroir dichroïque dans le support et le lieu à 45 ° dans le cube en cage. </li><li> Vissez la lentille de l&#39;objectif, via une RMS pour SM1 adaptateur de filetage et d&#39;un tube lentille réglable, à la face du cube en cage en face de la porte-lentille de tube. Un z-traducteur peut être utilisé à la place du tube de lentille réglable pour faciliter la mise au point. Vis un connecteur SMA dans une plaque de cage et de monter ce sur les tiges, approximativement à la distance de travail de l&#39;objectif. </li><li> Monter une LED sur une plaque en cage et glisser sur la fin de la 2 &quot;barres. Ajouter une lentille à un 0,5&quot; tube d&#39;objectif tel que, lorsque ce tube est vissé dans le côté du cube en cage, il va former une image de la LED qui remplit l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif. Cette configuration (éclairage de Köhler) fera en sorte que la face proximale du faisceau de fibres optiques est uniformément éclairé. Ajouter le filtre d&#39;excitation dans le tube 0,5 lentilles &quot;et fixer en place avec un anneau de retenue (figure 1c). </li><li> Attachez un connecteur SMA à un faisceau de fibres optiques. Vissez le bundle SMA connectorisés dans le réceptacle de SMA montés sur les tiges de la cage. Direct de l&#39;extrémité distale du faisceau vers une source lumineuse à large bande (éclairage fluorescent suffira) et d&#39;observer l&#39;image du visage bundle proximale sur la caméra CCD. Ajustez la position de la lentille de l&#39;objectif en vissant ou en dehors du cube cage jusqu&#39;à ce que l&#39;image apparaît dans faisceau de fibres de discussion. Les noyaux individuels devraient être clairement visibles (figure 2). </li></ol> 2. Assemblée Objectif GRIN La résolution spatiale de l&#39;microendoscope peut être augmentée en ajoutant un micro-lentille ou d&#39;assemblage de lentilles à l&#39;extrémité distale du faisceau de fibres. Ces optiques sont configurés de telle sorte que, au lieu de placer la pointe bundle directement sur le tissu, la pointe est reflétée sur la surface du tissu avec démagnification, augmentant ainsi la fréquence d&#39;échantillonnage spatiales imposées par le GUID lumièreING noyaux du faisceau de fibres. Le degré de démagnification correspond à l&#39;augmentation de la résolution spatiale, et dans le même temps, à une diminution proportionnelle dans le champ de vision. Composants lentilles à gradient d&#39;indice (GRIN) sont compatibles avec la fibre optique et sont disponibles à partir GrinTech, NSG, Schott, entre autres, et peut être directement lié à l&#39;extrémité distale d&#39;un faisceau de fibres. <ol><li> Sélectionnez une lentille GRIN avec le grossissement désiré et la distance de travail pour votre application. S&#39;assurer que le diamètre de la lentille est supérieure à celle du faisceau de fibres que vous prévoyez de travailler avec. Nous recommandons que le faisceau de fibres et de lentilles GRIN être monté sur 3 axes séparés platines de positionnement manuel sous un microscope de faible puissance ou stéréoscope pour un alignement précis avant le collage. </li><li> Déposer une goutte de colle optique (par exemple, Norland adhésifs UV) sur la lentille ou le visage bundle. Apportez les deux composantes en contact en utilisant les positionneurs manuel. Exposer l&#39;interface à la lumière UV pour la dose recommandée par le fabricant. </li><li> Pour protéger la lentille GRIN et l&#39;interface collés, une courte longueur de tube d&#39;aluminium capillaire (petites pièces Inc) peut être utilisé pour enfermer l&#39;articulation. Faites glisser le tube sur le joint et fixer en place à l&#39;époxy. Gaine thermorétractable peut être utilisée pour terminer l&#39;assemblage. </li></ol> 3. Imagerie Microendoscope <ol><li> Appliquer l&#39;agent de contraste pour les cellules ou les tissus à imager. Avec proflavine (0,01% p / v dans du PBS), dans l&#39;imagerie in vitro des cellules en culture peut être effectuée par une brève incubation (&lt;1 minute) et un rinçage complet. Imagerie des spécimens de tissus ex vivo ou in vivo dans les tissus est possible après l&#39;application topique de la teinture. L&#39;absorption de proflavine dans ces conditions, a été trouvé pour être quasi instantanée, avec l&#39;imagerie possible en quelques secondes et durable pendant plusieurs minutes. </li><li> Placez le faisceau de fibres optiques en contact léger avec l&#39;échantillon à imager. Lorsque les cellules d&#39;imagerie dans la culture ou ex vivo des échantillons de tissus, nous recommandons le montage de l&#39;extrémité distale du faisceau de fibres dans un dispositif de sécurité avec des étapes de positionnement manuel sur les axes XYZ pour la stabilité pendant l&#39;imagerie. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Une fois assemblé correctement, le microendoscope fonctionnera comme un microscope à épifluorescence, relayée par une stratégie cohérente de fibre optique bundle. Pour des résultats optimaux d&#39;imagerie, l&#39;attention devrait être accordée pour s&#39;assurer que trois conditions principales sont remplies: <ol><li> La face proximale du faisceau de fibres devrait être imagés sur la caméra CCD sans défocalisation, afin de parvenir à la résolution complète du système. Figure 2a, b, c montrent une partie d&#39;un faisceau de fibres imagé avec un accent pauvres, défocalisation légère, et se concentrer bonne, respectivement. L&#39;accent est optimale en ajustant la position axiale de la lentille de l&#39;objectif relativement à la face bundle. </li><li> La face proximale du faisceau de fibres doivent être uniformément éclairée sur son plein diamètre (champ de vision). Comme décrit dans le texte du Protocole (1,7), ceci est réalisé en configurant l&#39;optique d&#39;illumination pour l&#39;éclairage de Kohler. Figure 2D montre une image acquise lors d&#39;un échantillon homogène fluorescente est illuminé dans cette configuration préférée, avec la figure 2e démontrant le résultat correspondant sous un éclairage critique. Dans ce dernier cas, la structure de la LED est reflétée sur le visage faisceau de fibres, résultant en l&#39;apparition de ce modèle indésirables superposée à la structure de l&#39;échantillon vrai. </li><li> Les deux visages proximales et distales du faisceau de fibres doit être propre et exempt de rayures et de copeaux. Figure 2f démontre la présence de débris attachée à la face bundle, avec des dégâts sous la forme d&#39;une petite puce à 5 heures sur le périmètre de la fibre. Les débris peuvent être retirés de la liasse des visages par le nettoyage de la même façon que conventionnelles connecteurs à fibres optiques, avec du papier d&#39;objectif et l&#39;isopropanol, ou des outils standard de nettoyage de fibre optique. Si l&#39;une des extrémités du faisceau de fibres est rayé ou ébréchées, ou si le faisceau des pauses le long de sa longueur, le visage peut être poli à plat par manuel standard, ou des techniques de polissage mécanique. Nous vous recommandons de 12-15 um clapotis de papier pour un poli initial grossier, avec un vernis final sur du papier de 0.5 à 1.0 um. </li></ol> La figure 3a montre l&#39;imagerie de 1483 cellules in vitro, après marquage avec le placement proflavine et la lumière du faisceau de fibres nues sur l&#39;échantillon. Figure 3b montre l&#39;amélioration de la résolution spatiale et la réduction du champ de vision fourni par une lentille GRIN 2.5x collée à l&#39;extrémité bundle. Film 1 montre l&#39;imagerie in vivo de la plaquette mammaires de graisse dans un modèle murin. Ici, un faisceau de fibres avec 0,5 mm de diamètre extérieur (330 um champ de vue) a été passé à travers une aiguille de calibre 21 et avancé dans le tissu. Les cellules adipeuses sont clairement visibles, avec des mouvements dus au cycle cardiaque apparente dans cette acquisition à 15images par seconde. La figure 3c montre l&#39;imagerie de la muqueuse buccale chez un volontaire humain sain, en utilisant cette fois un ensemble plus large en fibre avec 1,5 mm de diamètre extérieur (1,4 mm champ de vue). Dans tous les exemples présentés, proflavine a été utilisé comme un agent de contraste marquage nucléaire fluorescent. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Assemblage du microendoscope haute résolution (HRME). Schéma (a) du système HRME. (B) de l&#39;Assemblée de la structure de soutien optomécanique principal. (C) l&#39;ajout d&#39;éléments optiques, éclairage LED, et une caméra CCD. (D) photographie du système HRME, emballé dans un 10 &quot;x 8&quot; x 2,5 &quot;enclos. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Configuration du HRME. Des exemples de l&#39;imagerie avec le faisceau de fibres optiques en (a) se concentrent pauvres, (b) à proximité de concentrer une bonne, (c) focalisation idéale. En (d), une cible homogène fluorescente à l&#39;extrémité distale du bundle est imagé dans Kohler (uniforme) d&#39;illumination. (E) un objectif uniforme fluorescente sous un éclairage critique imagée, avec la structure apparente de la source sur l&#39;objet. (F) les tissus en vrac et les cellules peuvent se coller au visage faisceau de fibres, qui est également sujette à des dommages mineurs à sa périphérie. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Imagerie avec le HRME. (A) 1483 cellules in vitro, imagé avec un faisceau de fibres nues (IGN-08/30) suivant le marquage avec proflavine 0,01% (p / v). (B) Le même 1483 la culture de cellules, comme indiqué en (a), imagé avec un faisceau de fibres avec une lentille GRIN 2.5x ci-joint. (C) Image de la muqueuse buccale normale humains in vivo, après l&#39;application topique de proflavine 0,01% (p / v). Film 1. Imagerie mammaire de la plaquette en graisse d&#39;un souris via l&#39;insertion d&#39;un diamètre de 450 um faisceau de fibres extérieures dans la lumière d&#39;une aiguille de calibre 21 passés dans le tissu. Proflavine 0,01% (p / v) a été livré sur le site d&#39;imagerie par la même aiguille avant l&#39;insertion de la fibre d&#39;imagerie. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a>

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MP et DY n&#39;ont rien à révéler. RRK détient des brevets relatifs aux plates-formes d&#39;imagerie microendoscopic.

La technique de haute résolution microendoscopy décrit fournit ici des chercheurs dans les domaines de la recherche biomédicale fondamentale et clinique avec une méthode flexible, robuste et rentable pour la visualisation de détails cellulaires in situ. Nous avons décrit un protocole pour l&#39;assemblage du système d&#39;imagerie et démontré son utilisation en culture cellulaire in vitro et chez l&#39;animal, et les tissus humains in vivo. Bien que les résultats présentés ici imagerie utilisée proflavine comme agent de contraste fluorescents, d&#39;autres groupes ont démontré les versions du système d&#39;éclairage à LED longueurs d&#39;onde et les filtres choisis pour correspondre à excitation / émission des spectres d&#39;autres colorants 5-7. Résolution et champ de vue sont déterminés initialement par l&#39;espacement des core-to-core et le diamètre de l&#39;imagerie du faisceau de fibres optiques. Nous avons utilisé faisceaux avec environ 4 um core-core espacement, et des diamètres de 330 um d&#39;imagerie (film 1), 720 um (figure 2, figure 3a, b), et 1400 um (figure 3C). Les faisceaux plus petits peut être transmis par des aiguilles de calibre étroit et sont nettement plus souples que les fibres plus grandes. Nous et les autres 8 ont, dans certains cas, a noté l&#39;apparition d&#39;émissions de l&#39;autofluorescence de la fibre elle-même bundle. Lors d&#39;une tentative pour exciter des fluorophores aux longueurs d&#39;ondes UV, ou de collecter des émissions dans la gamme spectrale rouge, une attention devrait être portée au niveau de l&#39;autofluorescence fibré contribuant à l&#39;ensemble du signal mesuré. Alors que la plupart des travaux à haute résolution microendoscopy rapporté à ce jour a utilisé un faisceau de fibres nues, un grossissement supplémentaire peut être fournie par l&#39;utilisation de lentilles GRIN collée à l&#39;extrémité distale. Lentilles GRIN offre un moyen simple et économique pour augmenter la résolution spatiale, bien que leur sensibilité aux aberrations optiques et limité NA est bien reconnu. Si les performances lentilles GRIN est insuffisante pour une application particulière, GRIN hybride / objectifs lentille sphérique 9 ou miniatures assemblées objectif 10-11 peuvent être employées. Le microendoscope haute résolution décrit ici essentiellement fonctionne comme un grand champ épifluorescence microscope; donc pas de sectionnement optique (comme en microscopie confocale ou non linéaire) est à prévoir. Dans notre expérience, en utilisant la lumière d&#39;excitation 455 nm et proflavine actualité comme agent de contraste, la lumière est principalement recueillies à une profondeur correspondant à une des couches de cellules rares. Ce protocole devrait permettre au lecteur de rassembler les microendoscope haute résolution sur la paillasse, avec un encombrement réduit de 10 &quot;x 8&quot;. Si désiré, le système peut être enfermé dans une boîte et les composants électriques (LED et d&#39;une caméra) alimenté par une batterie (figure 1d). Beaucoup de caméras compactes peuvent être alimentés par l&#39;IEEE-1394 (Firewire) et des ports USB de l&#39;ordinateur hôte.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

De nombreuses études biologiques et cliniques nécessitent l&#39;étude longitudinale et l&#39;analyse de la morphologie et la fonction avec une résolution au niveau cellulaire. Traditionnellement, les multiples expériences fonctionnent en parallèle, avec des échantillons individuels retirés de l&#39;étude à des temps séquentiels pour l&#39;évaluation par microscopie optique. Plusieurs techniques ont été développées intravitale, avec confocale, multiphotonique, microscopie et deuxième harmoniques toutes démontrant leur capacité à être utilisé pour l&#39;imagerie dans une situ. Avec ces systèmes, cependant, l&#39;infrastructure nécessaire est complexe et coûteuse, impliquant des systèmes de balayage laser et les sources de lumière complexes. Nous présentons ici un protocole pour la conception et l&#39;assemblage d&#39;un microendoscope haute résolution qui peut être construite en un jour à l&#39;aide off-the-shelf composants pour moins de 5000 $ US. La plateforme offre une grande flexibilité en termes de résolution d&#39;image, le champ de vision, et l&#39;exploitation d&#39;onde, et nous décrivons comment ces paramètres peuvent être facilement modifiés pour répondre aux besoins spécifiques de l&#39;utilisateur final. Nous et les autres ont exploré l&#39;utilisation de l&#39;microendoscope haute résolution (HRME) en culture cellulaire in vitro 2-5, en 6 excisée et les tissus des animaux qui vivent 2,5, et dans les tissus humains in vivo 2,7. Les utilisateurs ont rapporté l&#39;utilisation de plusieurs agents de contraste fluorescents, y compris proflavine 2-4, anneau de monoacide benzoporphyrine dérivés A 5 (BPD-MA), et 6,7 fluorescéine, qui ont tous reçu plein, ou l&#39;approbation d&#39;investigation de la FDA pour une utilisation chez des sujets humains. Haute résolution microendoscopy, sous la forme décrite ici, peut faire appel à un large éventail de chercheurs travaillant dans le domaine des sciences fondamentales et cliniques. Cette technique offre une approche efficace et économique qui complète la microscopie traditionnelle paillasse, en permettant à l&#39;utilisateur d&#39;effectuer à haute résolution, imagerie longitudinales in situ.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging at JoVE.com

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Dans de nombreuses situations cliniques et biologiques, il est avantageux d&#39;étudier les processus cellulaires à mesure qu&#39;ils évoluent dans leur microenvironnement natale. Nous décrivons ici le montage et l&#39;utilisation d&#39;un faible coût par fibre optique de microscope qui peut fournir l&#39;imagerie en temps réel dans la culture cellulaire, les études animales et des études cliniques sur le patient.

Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.3K vues.  Rice University. Dans de nombreuses situations cliniques et biologiques, il est avantageux d'étudier les processus cellulaires à mesure qu'ils évoluent dans leur microenvironnement natale. Nous décrivons ici le montage et l'utilisation d'un faible coût par fibre optique de microscope qui peut fournir l'imagerie en temps réel dans la culture cellulaire, les études animales et des études cliniques sur le patient.

Vidéo: High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Recherche

Bio-ingénierie

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Microscopie à balayage vidéo confocale et à taux Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopie Spectroscopy Fiber-bundle pour non-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;analyse des tissus

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Installation optimisée et protocole d’imagerie de domaines magnétiques sur mesure In Situ de hystérésis

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Imagerie 3D à haute résolution du réseau Neuro-insulaire pancréas humain

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Haute résolution Patterned Biofilm dépôts en utilisant pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...