Les auteurs tiennent à remercier M. Sven Holder et M. Stephen Conley pour leur aide précieuse dans cette étude. Ce travail a été financé en partie par l&#39;Institut national de la Santé [numéro Grant R00CA134920] et l&#39;American Lung Association [numéro de RG Grant-194681-N]. NinePoint Medical Inc parrainé les coûts associés à la publication de ce manuscrit.

1. Système d&#39;imagerie Les détails techniques de ces investissements ont été décrits précédemment 4-6. Circonférentielle investissements étaient menés à des vitesses d&#39;imagerie entre 25 et 100 images par seconde et entre 512 et 2.048 profils de profondeur axiale par circulaire en coupe transversale d&#39;image. Cathéters mesure 2,4 Fr (0,8 mm de diamètre) à balayage hélicoïdal utilisées dans cette étude ont été conçus pour fonctionner à travers l&#39;orifice d&#39;accès bronchoscopes standard. Les cathéters consistait en un noyau interne optique pour focaliser la lumière sur la paroi bronchique et une gaine externe à usage unique. Le corps de cathéter est resté immobile pendant l&#39;imagerie tandis que le noyau interne est mis en rotation à une vitesse comprise entre 25 et 100 Hz et traduite à une vitesse de retrait compris entre 1,25 et 5 mm / sec. La résolution axiale du système est de 6 mm dans les tissus et fourni une profondeur d&#39;image allant de 7,3 mm 4-6. À base de cathéter investissements étaient effectués dans cette étude se répliquer in vivo bronchoscopique investissements à l&#39;étranger (Figure 1). Cependant, ce protocole peut également être appliquée à l&#39;imagerie d&#39;un système de paillasse optique (Figure 3 et 4). 2. Système d&#39;imagerie Set-up <ol><li> Allumez le système d&#39;imagerie </li><li> Régler et enregistrer les paramètres d&#39;imagerie (vitesse de rotation, vitesse de retrait, le taux d&#39;acquisition de l&#39;image, etc.) Pour le système d&#39;imagerie investissements à l&#39;étranger utilisé dans cette étude, les images ont été obtenues à 10-50 fps. </li><li> Fixez cathéter à la jonction rotative et un dispositif de retrait. </li><li> Spin cathéter et vérifier la qualité d&#39;image. Régler l&#39;alignement du système et de compenser au besoin. </li></ol> 3. Préparation des tissus <ol><li> Placez une table tampon absorbant jetable sur la paillasse et le spécimen du poumon jeu sur le clavier. </li><li> Si un spécimen d&#39;imagerie chirurgicale ex vivo à partir d&#39;un patient, assurez-vous de consulter le service de pathologie afin de s&#39;assurer que toutes les marges de résection (marges bronchiques, vasculaires et parenchymateuses) ont été évalués, documentés et / ou supprimés par un pathologue. </li><li> Identifier l&#39;bronchique entrer dans la pièce d&#39;exérèse au niveau du hile. Retirez tout le mucus visible dans les voies respiratoires à l&#39;aide d&#39;une seringue portait. Si nécessaire, attacher un segment plus long tube de plastique sur la seringue portait à l&#39;aspiration plus profonde dans les voies respiratoires. </li><li> Palper la surface extérieure de l&#39;échantillon afin d&#39;identifier la lésion de l&#39;intérêt. </li><li> En utilisant une sonde métallique fine, délicatement naviguer dans l&#39;arbre bronchique jusqu&#39;à proximité de la lésion d&#39;intérêt. </li><li> Ouvrir les voies aériennes le long de la sonde jusqu&#39;à ce que la lésion d&#39;intérêt est visible ou palpable sous la muqueuse des voies aériennes. </li><li> Retirer soigneusement toute trace de sang ou de mucus de la muqueuse des voies aériennes recouvrant la lésion avec un coton-tige. </li><li> Placer le cathéter au-dessus de ces investissements la muqueuse des voies aériennes et d&#39;obtenir une image de confirmer la lésion est sous-jacente à la muqueuse des voies aériennes et d&#39;identifier une région de formation d&#39;image de haute qualité pour la corrélation d&#39;intérêts histologie. </li></ol> 4. Marquage des tissus <ol> &lt;li&gt; Sélectionnez la région d&#39;intérêt dans les voies respiratoires en fonction des résultats d&#39;imagerie antérieurs à l&#39;étape 3.8. </li><li> Choisir deux points sur le tissu le long de la ligne souhaitée d&#39;imagerie. Les points peuvent être parallèles soit à la direction longitudinale (Figure 2) ou périphérique (figure 3) Aspect de la voie aérienne, en fonction des résultats souhaités. Points d&#39;espace pas plus de 1,5 cm en dehors de sorte que la portion de tissu peut tenir dans un bloc d&#39;histologie pour le traitement. Si une longueur de tissu de&gt; 1,5 cm est nécessaire, puis diviser la longueur du tissu dans de multiples 1,5 cm de long encrés régions d&#39;intérêt de créer plusieurs images appariés: paires histologie. </li><li> Trempez une amende pencher ouvert aiguille creuse (c.-à calibre 25 7/8 &quot;de long) dans le tissu marquage colorant (Triangle sciences biomédicales, Durham, Caroline du Nord). </li><li> Essuyez soigneusement l&#39;excès d&#39;encre sur l&#39;extérieur de l&#39;aiguille avec de la gaze, laissant l&#39;encre uniquement au marquage du tissu à l&#39;intérieur de l&#39;aiguille alésage. </li><li> Piquer la perpendiculaire du tissu de la muqueuse des voies aériennes à l&#39;choisie point le long de la ligne de formation d&#39;image. </li><li> Répéter les étapes de 3,3 à 3,5 pour le second point sur la muqueuse des voies aériennes. </li><li> Si l&#39;encre déborde de la surface muqueuse loin du site de ponction, utilisez un coton-tige pour enlever soigneusement l&#39;excès d&#39;encre. </li><li> Éliminer le mucus ou de sang sur la surface de la muqueuse des voies aériennes avec un coton-tige, si elle est présente. </li><li> Si les points d&#39;encre sont placées à l&#39;intérieur de la circonférence d&#39;une voie aérienne, il est utile de la broche ouverte des deux côtés de la voie aérienne pour aplatir le tissu dans le domaine de l&#39;imagerie (figure 3a). </li></ol> 5. Tissu d&#39;imagerie <ol><li> Placer le cathéter investissements à l&#39;étranger au cours de chaque marque à l&#39;encre et l&#39;image de s&#39;assurer que les marques sont visibles sur ces investissements. Marques doivent apparaître comme des perturbations de liaison au sein de la structure de tissu recouvrant avec des particules de dispersion fortement sous-jacent et d&#39;atténuation de signal rapide, ce qui correspond à des particules d&#39;encre à l&#39;intérieur du site de ponction (figure 3b, la figure 4a, la figure 4g </strong&gt;). </li><li> Si de l&#39;encre marque (s) ne sont pas visibles sur les investissements à l&#39;étranger, répétez les étapes 4,3 à 4,7 pour les marques non visibles. Si les marques d&#39;encre sont visibles à ces investissements, passez à l&#39;étape 5.3. </li><li> Placer le cathéter en parallèle aux deux marques d&#39;encre sur la surface des voies respiratoires telles que les muqueuses optique cathéter recouvrir le tissu au-delà de la première marque d&#39;encre (Figure 2b). L&#39;ancrage de l&#39;extrémité proximale du cathéter avec un objet léger et fixer l&#39;extrémité distale peut aider à réduire les artéfacts de mouvement. </li><li> Procéder au prélèvement d&#39;un recul investissements à l&#39;étranger. </li><li> Voir les images recul investissements à l&#39;étranger pour s&#39;assurer que les deux marques d&#39;encre sont visibles en imagerie et pour vérifier les artefacts de mouvement (Figure 3 et Figure 4). Si les marques ne sont pas visibles, répétez les étapes 5,1 à 5,4. </li></ol> 6. Collecte et traitement des tissus <ol><li> Placez une encre verte dot (Triangle sciences biomédicales, Durham, Caroline du Nord) sur le tissu des muqueuses des voies respiratoires afin d&#39;orienter le début de l&#39;analyse d&#39;imagerie, de 0,3 cm de emarque à l&#39;encre électronique qui est apparu d&#39;abord dans le repli d&#39;imagerie (figure 2c). </li><li> Éliminer les tissus entourant les deux marques d&#39;encre noire et l&#39;encre verte marque. Coupez le tissu pour tenir dans une cassette de traitement histologie standard. Si l&#39;on coupe le tissu frais est difficile, puis le tissu peut être fixé avant d&#39;enlever le tissu pour l&#39;histologie. </li><li> Tissus place dans une cassette de traitement de l&#39;histologie et la solution formol à 10% pendant au moins 48 heures. </li><li> Tissus processus dans un processeur tissu, disponible dans n&#39;importe quel département de l&#39;histologie. </li><li> Incorporer le tissu dans de la paraffine de sorte que les sections découpées sont parallèles aux deux marques d&#39;encre noire sur la surface des voies respiratoires. </li><li> Utilisez un microtome tissu pour faire face au bloc de paraffine jusqu&#39;à ce que soit une marque d&#39;encre est visible ou la coupe de tissu est entièrement visible, selon la première éventualité. </li><li> Une fois que les deux marques d&#39;encre noire sont visibles, coupez une section 5 um d&#39;épaisseur et monter sur une lame de verre. </li><li> Continuer à découper et à monter 5 um sections épaisses chaque50 pm jusqu&#39;à ce que les marques d&#39;encre noire ne sont plus visibles ou les extrémités du tissu, selon la première éventualité. </li><li> Suivez norme hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration des protocoles pour tacher et diapositives lamelle. </li></ol> 7. Traitement d&#39;image Si les images ont été acquises avec un scanner de table, ou autre technique de balayage où les deux marques d&#39;encre sont visibles dans une seule image en coupe transversale, l&#39;image peut être directement corrélée avec l&#39;histologie correspondante. Si volumes de données ont été acquises avec un cathéter à balayage hélicoïdal, les images devront être ré-interpolée de sorte qu&#39;une seule image 2D divise les deux marques d&#39;encre pour la corrélation avec l&#39;histologie. Cela peut être accompli en utilisant ImageJ ou un autre logiciel de traitement d&#39;image. Dans certains cas, l&#39;encre peut ne pas être visible dans ce cas, les sections adjacentes / diapositives doivent être examinés.

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Évaluation des tumeurs malignes du poumon précoce peut être extrêmement difficile en raison de l&#39;absence de symptômes et de l&#39;incapacité à visualiser les premières transformations néoplasiques ou radiologiquement bronchoscopie. Investissements à l&#39;étranger fournit près résolution histologique, grand espace en 3 dimensions vue de la microstructure des tissus en temps réel 2-6. Endobronchique investissements à l&#39;étranger a été démontrée chez les patients comme une technique sûre qui peut être utilisé pour obtenir une haute résolution volumes de données sur les segments des voies aériennes longues voies aériennes pulmonaires 11-13 (Animation). Cependant, seules les petites biopsies sont obtenues comme homologues histopathologiques dans le cadre de vivo, qui ne fournissent pas de corrélats nécessaires pour ces investissements pour le développement de critères d&#39;imagerie pour la pathologie pulmonaire. Afin d&#39;évaluer avec précision les caractéristiques investissements à l&#39;étranger vus en imagerie pulmonaire, il est essentiel d&#39;obtenir une image parfaitement adaptés aux corrélations histologiques. Nous présentons une méthode simple et efficace pour précision, l&#39;un pour ocorrélation entre les investissements à l&#39;étranger ne et l&#39;histologie appliquée à l&#39;imagerie aérienne de spécimens ex vivo résection pulmonaire, qui est applicable à presque n&#39;importe quel type de tissu in vivo ex. Une fois les critères d&#39;imagerie ont été créés ex vivo avec correspondance un-à-un histologie, ces critères peuvent ensuite être appliqués à l&#39;imagerie in vivo. Le colorant du tissu utilisé pour marquer la zone d&#39;exposition d&#39;intérêt est clairement visible dans les deux investissements à l&#39;étranger et l&#39;histologie. À l&#39;aide de techniques simples pour orienter le tissu, marques d&#39;encre peut être corrélée à la fois dans l&#39;imagerie et l&#39;histologie pour permettre une à une comparaison des caractéristiques et des résultats histologiques investissements directs afin de déterminer les caractéristiques d&#39;imagerie identifiables de la pathologie des tissus. La technique est peu coûteux et pratique, ce qui le rend utile dans de nombreuses applications d&#39;imagerie optique. Dans le cadre de vivo, des méthodes telles que le marquage au laser peut être utilisé pour 25 l&#39;orientation du tissu. Toutefois, til petite taille de la biopsie bronchique est toujours un facteur limitant dans l&#39;utilisation des études in vivo pour élaborer des critères spécifiques pour l&#39;imagerie pathologie pulmonaire. Bien que les études ex vivo servir d&#39;alternative adéquate pour l&#39;imagerie in vivo, il existe certaines limites. Ex échantillons pulmonaires in vivo sont dégonflé et affichent souvent une atélectasie chirurgicalement induite, ce qui modifie l&#39;apparence des structures alvéolaires normales. Gonfler le tissu pulmonaire réséqué chirurgicalement avec marquage de tissu pour la corrélation histologique est techniquement difficile car la plupart des spécimens pulmonaires chirurgicales sont reçus après évaluation section de pathologie congelés au cours de laquelle la surface pleurale est perturbé, interférant avec l&#39;inflation spécimen. Non pathologique atélectasie n&#39;est pas un artefact vu dans le cadre de vivo, donc cette limitation ne serait pas pertinente pour l&#39;imagerie pulmonaire in vivo. En outre, le manque de sang dans les vaisseaux dans des échantillons ex vivo pourrait rendre difficile la distinguish structures vasculaires des autres structures vides de signal. Dans le cadre de vivo, l&#39;ajout de Doppler OCT / investissements à l&#39;étranger à 26-28 structurelle OCT / investissements à l&#39;étranger aiderait à l&#39;identification des navires. Les artefacts de mouvement peuvent être observés in vivo où ils ne sont pas ex vivo présente. Cela pourrait être potentiellement problématique dans la norme des systèmes OCT avec des vitesses d&#39;acquisition plus lente. Cependant, les taux de rafraîchissement rapides des systèmes investissements à l&#39;étranger sont actuellement&gt; 200 fps 29-31. Ainsi, il n&#39;est pas prévu que artefact de mouvement sera une question importante. Précédente in vivo PTOM et investissements à l&#39;étranger des études d&#39;imagerie ont démontré avec succès la visualisation des fonctions d&#39;imagerie fines 14,15,18,19. Dans cette étude, nous avons démontré volumétrique investissements à l&#39;étranger avec une corrélation précise des tissus à base de diagnostic pour évaluer la pathologie pulmonaire. Le mode opératoire décrit est destiné à fournir histologie précisément identifié pour être utilisé comme l&#39;or standae pour l&#39;interprétation des images investissements à l&#39;étranger. Une fois les critères d&#39;imagerie spécifiques pour la pathologie pulmonaire ont été développées et validées ex vivo avec correspondance un-à-un histologie, les critères peuvent ensuite être appliqués à la suite des études d&#39;imagerie in vivo avec l&#39;utilisation d&#39;une biopsie bronchique comme une évaluation étalon-or de l&#39;imagerie Caractéristiques vu. Cette technique est présentée comme une demande de pièces d&#39;exérèse pulmonaire, mais peut être appliquée à presque n&#39;importe quel type de tissu pour fournir l&#39;imagerie précise de la corrélation histologique nécessaire pour déterminer les caractéristiques d&#39;imagerie fines des tissus normaux et pathologiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Colorant tissu marquage </td><td> Triangle biomédicale </td><td> TMD-BK, TMD-G </td><td></td></tr></tbody></table>

optical frequency domain imaging of ex vivo pulmonary resection specimens: obtaining one to one image to histopathology correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Les marques d&#39;encre noire doit être comprise entre 1 à 1,5 cm de distance pour indiquer la zone d&#39;exposition d&#39;intérêt. La marque à l&#39;encre verte doit être placé au début de la numérisation d&#39;imagerie, avant que la marque d&#39;encre noire premier à orienter l&#39;échantillon (Figure 2 et Figure 3a). Marques d&#39;encre de tissus devraient être visibles à la fois sur l&#39;imagerie et l&#39;histologie investissements à l&#39;étranger (figure 3 et 4). Chez les porcs normaux (Figure 3) et les voies respiratoires de l&#39;homme (figure 4), marcottage aérien typique devrait être visible. L&#39;épithélium (E) est visible comme une fine modérément signaler dense, couche homogène à l&#39;aspect luminal de la voie aérienne. La lamina propria comprend organisée signal intense pour signal faible tissu, correspondant à différentes composantes de la lame (LP) propria comme signal intense des tissus conjonctifs, notamment le collagène et l&#39;élastine (EL), et un signal de mauvaise salivaire de type tissu glandulaire (G ). Il ya parfois des conduits de signaux visibles pauvres (D) qui traversent la respiépithélium ratoire à se connecter avec la lumière bronchique. Muscle lisse apparaît comme discontinu, entrecoupé fascicules musculaires lisses et n&#39;est donc pas identifiable dans ces investissements. Sur le H &amp; E et les taches trichrome, la superposition des voies respiratoires peuvent être visualisées (figure 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e et 4f), où le trichrome les superficielles denses tissus élastiques et de collagène apparaît d&#39;un bleu profond et le muscle lisse sous-jacent taches rouges (SM). Anneaux cartilagineux (C) apparaissent comme des signaux pauvres en forme de croissant de structures avec des limites bien définies, qui se chevauchent dans les voies respiratoires des porcs et ne se chevauchent pas dans les voies respiratoires de l&#39;homme. Le périchondre du cartilage entourant les anneaux se présente comme une couche mince de tissu signal intense englobant les cycles de signaux de cartilage pauvres. Dans les voies respiratoires périphérique humain (figure 4g et 4h), les pièces jointes alvéolaires (A) sont visibles sous forme de fines, de signaux intenses en forme de treillis avec des parois alvéolaires espaces vides de signal alvéolaires. Espaces vasculaires au sein de la lamina propria sont visible que des structures vides de signal linéaire ou circulaire avec une légère sous-jacente artefact observation (flèches). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig1.jpg" /> Figure 1. Investissements à l&#39;étranger des voies respiratoires du porc. En images in vivo obtenus à partir des voies aériennes porcine sous ventilation mécanique. (A) ODFI section de voie respiratoire proximale. (B) ces investissements section de voie respiratoire distale. (C) ODFI coupe longitudinale des voies aériennes proximales, plus fort grossissement de l&#39;image e panneau dans la région en surbrillance rouge. (D) coupe longitudinale d&#39;investissements à l&#39;étranger des voies aériennes distales, plus fort grossissement de l&#39;image e panneau dans la région surlignée en vert. (E) ODFI coupe longitudinale de voies aériennes de proximal à distal (gauche à droite). Diamètre du cathéter est de 0,8 mm et marques de graduation représentent incréments de 0,5 mm. Bien que les différentes couches de la paroi bronchique et les pièces jointes alvéolaires sont perceptibles dans les images investissements à l&#39;étranger, il est difficile d&#39;interpréter précisément le co anatomiquerrelate des signaux investissements à l&#39;étranger sans histologie directement enregistré. e: épithélium, lp: lamina propria, sm: sous-muqueuse, c: cartilage, un: les pièces jointes alvéolaires. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig2.jpg" /> Figure 2. Tissu marquage des voies respiratoires du porc. (A) Ouverture des voies aériennes avec deux marques à l&#39;encre noire sur la surface luminale placée parallèlement à l&#39;aspect longitudinal des voies respiratoires, 1,5 cm de distance. (B) investissements à l&#39;étranger cathéter placé plus de deux encre noire marque d&#39;inclure les deux marques au sein du recul investissements à l&#39;étranger. (C) des voies aériennes avec une marque d&#39;encre verte supplémentaire pour orienter le début du balayage d&#39;imagerie sur le spécimen. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3.jpg" /> Figure 3. Investissements à l&#39;étranger et l&#39;histologie des voies respiratoires du porc démontrant cor préciserelation en utilisant des tissus de marquage. (a) Ouvert voies aériennes avec deux marques à l&#39;encre noire sur la surface luminale placée parallèlement à l&#39;aspect périphérique de la voie aérienne. Les broches sont utilisés pour ouvrir davantage la voie aérienne (flèches). (B) investissements à l&#39;étranger des voies respiratoires du porc à la fois avec l&#39;encre marque visible (astérisques) à (c) teinté histologie précisément, corrélée avec H &amp; E (astérisques: encre noire marque visible sur l&#39;épithélium respiratoire) et (d) corrélation trichrome. Barre d&#39;échelle: 2 mm. (E) vue fort grossissement de l&#39;image de ces investissements avec (f) l&#39;histologie correspondante colorées avec H &amp; E et (g) corrélée trichrome. E: épithélium respiratoire, EL: collagène dense et tissus élastiques, SM: muscle lisse, C: anneaux cartilagineux (artefact histologique a entraîné la séparation artificielle des anneaux de cartilage), G: tissu de la glande salivaire, D: canal salivaire entrer épithélium. Barre d&#39;échelle: 250 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3855/3855fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4.jpg" /> Figure 4. Investissements à l&#39;étranger et l&#39;histologie des voies aériennes humaines démontrant une corrélation précise en utilisant des tissus de marquage. (A) investissements à l&#39;étranger des voies aériennes proximales de l&#39;homme à la fois avec l&#39;encre marque visible (astérisques). (B) teinté histologie précisément en corrélation avec H &amp; E à l&#39;encre noire marque visible sur l&#39;épithélium respiratoire (astérisques) et (c) corrélée trichrome. Barre d&#39;échelle: 2 mm. (D) vue fort grossissement de l&#39;image de ces investissements et (e) l&#39;histologie correspondante colorées avec H &amp; E et (f) trichrome. Barre d&#39;échelle: 250 um. E: épithélium respiratoire, LP: lamina propria, G: tissu de la glande salivaire, C: anneaux de cartilage, PC: périchondre. Dans les voies respiratoires de l&#39;homme, la stratification typique est visible. Dans le tissu conjonctif lâche, il fascicules sont entrecoupées de taches rouge-muscle lisse (SM, panneaux c et f), Qui ne forment pas une bande continue, et donc ne sont pas visibles dans une couche distincte de ces investissements. (G) de ces investissements voies aériennes humaines et distale (h) précisément corrélée H &amp; E histologie avec des marques visibles d&#39;encre noire sur l&#39;épithélium respiratoire (astérisque). Barre d&#39;échelle: 2 mm. Accessoires alvéolaires (A) sont visibles sous forme de signaux intenses en forme de treillis parois alvéolaires avec des espaces vides de signal alvéolaires. Espaces vasculaires au sein de la lamina propria sont également visibles en tant que signal de vide-structures avec des ombres légères sous-jacent (flèches).

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Procédé pour l&#39;image<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pièces de résection pulmonaire avec optique dans le domaine fréquentiel d&#39;imagerie (investissements à l&#39;étranger) et d&#39;obtenir des corrélations précises à l&#39;histologie est décrite, qui est essentielle à l&#39;élaboration de critères spécifiques d&#39;interprétation investissements à l&#39;étranger pour la pathologie pulmonaire. Cette méthode est applicable à d&#39;autres types de tissus et les techniques d&#39;imagerie pour obtenir des images précises à la corrélation d&#39;histologie pour l&#39;interprétation des images précises et d&#39;évaluation. Critères d&#39;imagerie établies avec cette technique serait alors applicable à l&#39;évaluation de l&#39;image à l&#39;avenir<em&gt; In vivo</em&gt; Études.

D&#39;imagerie optique du domaine de fréquence<em&gt; Ex vivo</em&gt; Les spécimens résection pulmonaire: Obtention One to One image à l&#39;histopathologie Corrélation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

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Bioengineering

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

14.0K vues.  Harvard Medical School. Procédé pour l'image Ex vivo Pièces de résection pulmonaire avec optique dans le domaine fréquentiel d'imagerie (investissements à l'étranger) et d'obtenir des corrélations précises à l'histologie est décrite, qui est essentielle à l'élaboration de critères spécifiques d'interprétation investissements à l'étranger pour la pathologie pulmonaire. Cette méthode est applicable à d'autres types de tissus et...

Vidéo: Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Recherche

Bio-ingénierie

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Intégré ophtalmoscopie photoacoustique et Spectral-domaine tomographie par cohérence optique

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a phospholipid and then self-assembled to liposome-like spherical vesicles. Due to the extremely high density of porphyrin in the porphyrin-lipid bilayer, porphysomes generated large extinction coefficients, structure-dependent fluorescence self-quenching, and excellent photothermal efficacy. In our formulation, porphysomes were synthesized using high pressure extrusion, and displayed a mean particle size around 120 nm. Twenty-four hr post-intravenous injection of porphysomes, the local temperature of the tumor increased from 30 &deg;C to 62 &deg;C rapidly upon one minute exposure of 750 mW (1.18 W/cm2), 671 nm laser irradiation. Following the complete thermal ablation of the tumor, eschars formed and healed within 2 weeks, while in the control groups the tumors continued to grow and all reached the defined end point within 3 weeks. These data show how porphysomes can be used as potent photothermal therapy (PTT) agents.

We developed novel intrinsic multifunctional nanovesicles called porphysomes, which have structure-dependent fluorescence self-quenching and unique photothermal properties, thus functioning as potent photothermal therapy agents. We formulated porphysomes using high pressure extrusion and investigated their photothermal therapy efficacy in a xenograft tumor model.

Une minute, Photothermal Tumor Ablation-un-Watt Sous Utilisation porphysomes, intrinsèque multifonctions nanovésicules

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

L&#39;utilisation de l&#39;<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler boucle Appareil pour évaluer la biocompatibilité des conduits de sang polymères modifiés

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomodensitométrie et l&#39;imagerie optique du couplage de l&#39;ostéogenèse-angiogenèse à évaluer l&#39;intégration des crâniens autogreffes et allogreffes

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Une méthode d’estimation fémur cadavériques souches corticale lors de Fracture corrélation d’images numériques à l’aide de tests

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...