Soutenue par l&#39;Université du Kentucky, Département de biologie, Bureau des études de premier cycle et le Collège des Arts et des Sciences.

Potentiel de membrane Dès 1902, Bernstein a été le traitement des questions d&#39;un potentiel de repos dans l&#39;axone d&#39;un calmar. Il est curieux d&#39;examiner comment ces premières idées et des observations de Berstein (1902) et de Nernst (1888) plus tard, influencé la recherche en physiologie de membrane. (Voir revue par Malmivuo et Plonsey, 1995; également disponible sur le www <a href="http://www.bem.fi/book/">http://www.bem.fi/book/</a> ). Il ya encore, à ce jour, les percées faites au sujet de la fonction des canaux ioniques et les propriétés des membranes biologiques qui sont très importants dans la compréhension de la physiologie cellulaire qui se rapporte à la fonction des tissus, organes et systèmes. La comparaison des effets expérimentaux et théoriques issus de l&#39;extérieur [K +] sur le potentiel de repos membranaire indique l&#39;influence des ions sur le potentiel de membrane. Des expériences complémentaires utilisant cette même préparation restent à effectuer pour répondre aux questions fondamentales physiologiques. Certains ont été mis en évidence en 1968 par Atwood et Parnas et n&#39;ont pas encore été entièrement traités. Avec les techniques obtenus dans cet exercice, on peut procéder pour répondre à de nombreuses questions qui restent dans les autres préparations expérimentales ainsi que dans les applications physiologiques liés à la médecine et la santé. Nous avons démontré l&#39;utilité d&#39;une préparation d&#39;invertébrés modèle pour répondre aux questions fondamentales pertinentes à tous les animaux. Grâce aux connaissances acquises sur les gradients électrochimiques des ions dans cet exercice ci-dessus, vous pouvez maintenant passer à l&#39;excitabilité des membranes en examinant la transmission synaptique neuromusculaire dans les préparations à l&#39;écrevisse. Mesure des réponses synaptiques Les détails fournis par la première partie de ce laboratoire, et le film associé, ont fourni les principales étapes pour l&#39;enregistrement de potentiels de membrane et d&#39;enquêter sur la structure musculaire. Dans la deuxième partie de ce laboratoire, la démonstration de la dissection et la transmission synaptique d&#39;enregistrement à la NMJs d&#39;unités motrices phasiques et toniques fourni une exposition à des concepts fondamentaux de la physiologie. L&#39;exposition à un circuit de neurones, qui peut en partie peut être utilisée pour expliquer les comportements associés, chez l&#39;animal intact a un potentiel non seulement pour les étudiants d&#39;étudier diverses questions ouvertes dans leur exercice de laboratoire, mais aussi pour de futures recherches sur les circuits neuronaux dans un puits la préparation d&#39;invertébrés établis (Kennedy et al, 1969;. Antonsen et Edwards, 2003) Ces préparations peuvent aussi être utilisées pour étudier la facilitation synaptique, la dépression et plasticité à long terme (pas étudiés dans cette étude en laboratoire). Même au sein de certaines espèces d&#39;écrevisses, de la plasticité neuronale dépend des conditions de stimulation expérimentale (Mercier et Atwood, 1989;. Cooper et al, 1998) ainsi que leur environnement naturel. Dans quelle mesure la capacité d&#39;altérer l&#39;efficacité synaptique et la dynamique musculaire sert de l&#39;animal reste à étudier. Depuis écrevisses ne modifient leur comportement en relation avec les variations saisonnières et du cycle de mue, il ya relativement différences d&#39;activité à long terme dans leurs systèmes neuromusculaires. Il a été démontré que les bornes phasique nerf moteur des muscles griffes présentent le plus proche morphologie classique phasique pendant l&#39;hiver, mais gonflent et deviennent plus varices le long de la borne pendant les mois d&#39;été (Lnenicka 1993; Lnenicka et Zhao, 1991). Certaines des premières études menées en écrevisses géantes latérales (LG) interneurones au sein de la corde nerveuse ventrale démontré la présence de jonctions lacunaires (Johnson, 1924; Watanabe et Grundfest, 1961). Il est bien connu que le CO 2 a un effet sur ​​la communication électrique par découplage jonctions gap (Arellano et al, 1990). Il a été récemment montré que la moelle épinière et de la communication au sein du circuit sensori-moteur-SNC-musculaires, telles que décrites dans ce rapport, est également sensible au CO 2 d&#39;exposition, indiquant la présence de jonctions lacunaires (Bierbower, 2010; Bierbower et Cooper, 2010) L&#39;activité spontanée de la racine 3 e moteur a été un sujet depuis les années 1960 lorsque Eckert (1961) a examiné si la tonique tirs statiques organe récepteur musculaire (MRO) dans le même segment ou voisins pourraient représenter pour le lecteur motrice spontanée. Dans ces études antérieures, il est devenu évident que l&#39;activité a été tirée dans la corde nerveuse ventrale (VNC), éventuellement des centres supérieurs (Eckert, 1961; Kennedy et Takeda, 1965a, b;. Strawn et al, 2000). Puisque la présence de CO 2 arrêté l&#39;activité spontanée, on peut supposer quelque part dans le lecteur pour les neurones moteurs pourrait y avoir des jonctions ou glutamatergiques excitateurs disque. Le NMJs sont bloqués ou présentent une sensibilité diminuée à la glutamate en présence de CO 2, et ils peuvent être du Blocked ainsi dans le SNC (Bierbower, 2010; Bierbower et Cooper, 2010; voir aussi Badre et al, 2005).. L&#39;action des neuromodulateurs différents est aussi facile a étudié à différents types de NMJs (Cooper et Cooper, 2009; Griffis et al, 2000;. Southard et al, 2000;.. Strawn et al, 2000). En outre, les diverses influences sont exercées par les neuromodulateurs du système nerveux central sur les circuits. Il a été suggéré que la 5-HT et les neurones octopaminergic peut fonctionner comme «gain-setters» dans la modification de la sortie des circuits neuronaux (Ma et al, 1992;. Schneider et al, 1996;. Horner et al, 1997;. Edwards et al., 2002). Beaucoup de travail reste à faire avant que nous ne pouvons comprendre pleinement les effets des neuromodulateurs sur les cellules cibles individuelles. Étant donné que les neuromodulateurs différents peuvent travailler de concert avec l&#39;autre, l&#39;analyse de leur action mixte est une zone pour des recherches futures (Djokaj et al., 2001). En outre, peu d&#39;études, en particulier chez les vertébrés, lutter contre les effets des neuromodulateurs ensemble sur les voies qui peuvent réguler un comportement spécifique. Dans cette préparation unité sensori-motrice SNC-on peut examiner l&#39;influence des deux entrées sensorielles et neuromodulateurs sur l&#39;activité des neurones moteurs (Kennedy et al., 1969). Comme il a été postulé que la 5-HT joue un rôle dans la régulation de l&#39;état comportemental du écrevisses, langoustes et des crabes (Livingstone et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000), plusieurs tentatives ont été faites pour déterminer sa concentration dans VNC, l&#39;hémolymphe, et dans les ganglions isolés de homards (Livingstone et al, 1980;. Harris-Warrick et Kravitz 1984;. Fadool et al, 1988). Cependant, il a été variations considérables dans les mesures enregistrées, ce qui exclut spécifiques relation dose-réponse qui pourrait rendre compte des mesures comportementales. Une écrevisse avec les griffes lieu dans une position surélevée et avec la queue repliées sous son abdomen a été pensé pour exposer une posture dominent (Livingstone et al., 1980). L&#39;état de flexion abdominale chez les écrevisses ne semble pas être la posture que l&#39;écrevisse dominante, dans une paire, présentent au cours des interactions sociales ou tout en conservant un statut dominant hiérarchique (Listerman et al., 2000). Soumise écrevisses vont même tuck leurs abdomens en eux-mêmes comme ils se retirent d&#39;un adversaire. Border la queue est également considéré comme une posture de défense (Listerman et al., 2000). Ces comportements ont été facilement observés sur le terrain et en laboratoire (Bovbjerg, 1953, 1956; Brousski et Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). Fait intéressant, les postures comportementales noté dans les homards (Livingstone et al., 1980) sont inversés pour la 5-HT et les injections octopamine dans les écrevisses australiennes, destructeur Cherax (McRae, 1996). Peut-être, des réponses tout à fait différente serait observé dans la préparation fléchisseur superficiel de l&#39;écrevisse australienne. En outre, depuis la domination est généralement de taille liés entre écrevisses, on s&#39;attendrait à un système de réponse très rapide en plastique pour modifier les conditions sociales (Strawn et al., 2000). La plasticité de la réactivité aux neuromodulateurs dans les invertébrés est un espace ouvert d&#39;enquête. Wyttenbach, Johnson, et Hoy (1999) ont produit des supports numériques et d&#39;un manuel de laboratoire pour les expérimentations impliquant les différents écrevisses musculaires mêmes présentées dans ce rapport, en plus de préparations autres écrevisses. Ceci est une excellente ressource pour les exercices des élèves.

<ol><li> Ecrevisses (Procambarus clarkii). Atchafalaya biologique Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard écrevisses salin: modification de la solution Van Harreveld (1936). (En mm) 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O; HEPES 5 et ajusté à pH 7,4. La sérotonine, glutamate et la dopamine sont faites dans une solution saline écrevisses. Solution de fixateur de Bouin a été utilisé directement et bleu de méthylène est faite dans une solution saline écrevisses. Tous les produits chimiques sont obtenus chez Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Des outils de dissection: Beaux # 5 pinces, ciseaux fins, porte-lame de couteau, des broches # 26002-20 insectes (tous obtenus à partir des outils Fine Science (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) . </li><li> Plat en verre à fond Sylgard </li><li> Béchers (pour retenir des solutions chimiques) </li><li> Les signaux électriques sont enregistrées sur la ligne à une interface PowerLab 26T à un ordinateur (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Nous utilisons un logiciel standard de ADInstruments nommé Chart ou la portée. </li><li> Modèle 3000 AC / DC amplificateur pour des enregistrements intracellulaires ainsi que extracellulaire peut être utilisé. </li><li> Loupe binoculaire avec fonction zoom pour les enregistrements intracellulaires. Pour l&#39;enregistrement de contact sur les bornes visualisés au microscope composé avec les objectifs debout (4 x et 20x) est utilisé. On a besoin d&#39;une source lumineuse Hg. </li><li> Pour les enregistrements intracellulaires nous utilisons tube capillaire en verre (catalogue # 30-31-0 du FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). L&#39;électrode intracellulaire doivent avoir une résistance de 20 à 30 Mohm. Électrodes intracellulaires ont été remplis avec 3 M de KCl. </li><li> Une électrode d&#39;aspiration est utilisé pour enregistrer des signaux extracellulaires. </li><li> Cage de Faraday. </li><li> Illuminateur à haute intensité (source lumineuse). </li><li> Micromanipulateur </li></ol>

membrane potentials, synaptic responses, neuronal circuitry, neuromodulation and muscle histology using the crayfish: student laboratory exercises

Le but de ce rapport est d&#39;aider à développer une compréhension des effets causés par des gradients d&#39;ions à travers une membrane biologique. Deux aspects qui influencent le potentiel de membrane d&#39;une cellule et que nous adressons dans ces expériences sont: la concentration d&#39;ions (1) de K + à l&#39;extérieur de la membrane, et (2) de la perméabilité de la membrane aux ions spécifiques. Les muscles extenseurs écrevisses abdominaux sont dans des groupes avec quelques toniques être (lent) et d&#39;autres phasique (rapide) dans leurs phénotypes biochimiques et physiologiques, ainsi que dans leur structure, les neurones moteurs qui innervent ces muscles sont également différent des caractéristiques fonctionnelles. Nous utilisons ces muscles ainsi que du superficiel, muscle fléchisseur tonique abdominale afin de démontrer les propriétés de la transmission synaptique. En outre, nous introduisons une sensori-SNC-neurone moteur du muscle circuit pour démontrer l&#39;effet de la stimulation sensorielle cuticulaires ainsi que l&#39;influence des neuromodulateurs sur certains aspects du circuit. Avec les techniques obtenus dans cet exercice, on peut commencer à répondre à plusieurs questions qui restent dans les autres préparations expérimentales ainsi que dans les applications physiologiques liés à la médecine et la santé. Nous avons démontré l&#39;utilité des préparations d&#39;invertébrés modèle pour répondre aux questions fondamentales pertinentes à tous les animaux.

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Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

Les expériences démontrent une approche facile pour les étudiants d&#39;acquérir une expérience dans l&#39;examen de la structure musculaire, les réponses synaptiques, les effets des gradients d&#39;ions et de la perméabilité sur les potentiels de membrane. En outre, un sensori-SNC-moteur du muscle circuit est présenté pour montrer un moyen de tester les effets de composés sur un circuit neuronal.

Potentiels de membrane, les réponses synaptiques, circuits neuronaux, neuromodulation et histologie muscle en utilisant l&#39;écrevisse: des exercices de laboratoire étudiant

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

membrane-potentials-synaptic-responses-neuronal-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

58.4K vues.  University of Kentucky. Les expériences démontrent une approche facile pour les étudiants d'acquérir une expérience dans l'examen de la structure musculaire, les réponses synaptiques, les effets des gradients d'ions et de la perméabilité sur les potentiels de membrane. En outre, un sensori-SNC-moteur du muscle circuit est présenté pour montrer un moyen de tester les effets de composés sur un circuit neuronal.

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Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Enregistrement des réponses comportementales à la réflexion chez les écrevisses

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Recherche

Neurosciences

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Enregistrements physiologiques des NMJs rendement élevé et faible sur le muscle extenseur écrevisses jambe

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Organes récepteurs musculaires à l&#39;abdomen des écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant de la proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings with a force transducer to monitor the strength of contraction. In addition, we demonstrate how to visually monitor peristaltic activity, which can be used as a bioassay for various peptides, biogenic amines and neurotransmitters. This preparation is amenable to student laboratories in physiology and for demonstrating pharmacological concepts to students. This preparation has been in use for over 100 years, and it still offers much as a model for investigating the generation and regulation of peristaltic rhythms and for describing the mechanisms underlying their modulation. The pharmacological assays and receptor sub-typing that were started over 50 years ago on the hindgut still contribute to research today. This robust preparation is well suited to training students in physiology and pharmacology.

In this report we demonstrate techniques that can be used to investigate the biology of the crayfish hindgut. We show how to dissect a crayfish abdomen and study the associated anatomy, physiology and modulation of activity. The peristaltic activity and strength of contractions are measured using a force transducer.

L&#39;expérimentation physiologique avec l&#39;intestin postérieur écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Proprioception et tension récepteurs en crabe Membres: Exercices de laboratoire étudiant

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Aigu<em&gt; In vivo</em&gt; Enregistrements électrophysiologiques des potentiels de terrain locaux et activité multi-unités à partir de la voie hyperdirect dans les rats anesthésiés

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...