Nous sommes reconnaissants à la Wellcome Trust et l&#39;ERC pour un soutien financier. IMGG est un Fellow EMBO. KLH est un étudiant BBSRC financé par un doctorat. Nous remercions Philip Rubin et Patrick Tidball pour le soutien de la culture technique et la cellule et le Dr Andrew Doherty pour l&#39;entretien et l&#39;assistance avec les microscopes.

1. Culture cellulaire, transduction virale, et l&#39;expression des protéines <ol><li> Neurones hippocampiques Culture à haute densité de embryonnaires ratons jour 18 (E18) sur des lamelles de verre poly-L-lysine pour 14-25 jours in vitro (DIV). </li><li> 6-24h avant les expériences en direct, les cellules transduisent avec atténué virus Sindbis contenant la protéine membranaire d&#39;intérêt, étiqueté avec le super-pHluorin écliptique (SEP). </li><li> Ajouter le milieu contenant pseudovirion directement à la lamelle contenant 1 ml de milieu conditionné et retourné à la culture de l&#39;incubateur. Le titre et l&#39;heure de l&#39;expression des protéines à la suite de transduction virale varie en fonction de la charge virale et doit être déterminée pour chaque lot avant de commencer les expériences de cellules vivantes. </li></ol> 2. FRAP-FLIP imagerie de cellules vivantes <ol><li> Equipement set-up <ol><li> Transférer la lamelle à la chambre de l&#39;imagerie d&#39;un microscope Zeiss Axiovert LSM 510 META confocale.Afin de minimiser les fluctuations de puissance lors de l&#39;imagerie, d&#39;assurer le microscope a été allumé, avec une sortie laser de 100%, pendant au moins 20 minutes avant l&#39;imagerie. </li><li> Immédiatement, remplacer le milieu de culture avec préchauffé (37 ° C) une solution d&#39;enregistrement extracellulaire contenant 140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 HEPES (pH ajusté à 7,4 avec NaOH) et placez la chambre sur la scène pré-chauffée (37 ° C) de la Axiovert Zeiss. Assurez-vous de l&#39;osmolarité de la solution d&#39;enregistrement extracellulaire est ajustée à moins de 10 mOsM de votre milieu de culture. Si aucune évaporation notable se produit au cours de la timecourse de l&#39;expérience, ce CO 2 solution indépendante est adapté pour de courtes expériences (&lt;10 heures). Compléter avec 1-2 mM de bicarbonate de sodium est recommandé. </li></ol></li><li> Définir les paramètres de capture d&#39;imagerie <ol><li> Tout d&#39;abord, identifier un neurone exprimant la pro recombinantprotéine d&#39;intérêt et de la mettre en focus. </li><li> Avec une huile 63X opposé, acquérir une image de la cellule en utilisant l&#39;ensemble 488nm d&#39;excitation de lumière laser à faible puissance laser. Afin de minimiser photoblanchiment, utilisez une vitesse rapide nominale (7-9) et la résolution pixel faible (512-512) de la tenue vitesse de balayage total &lt;1 seconde. </li><li> Sélectionnez une partie de dendrite à l&#39;image et le zoom pour capturer une image contenant le ROI (~ 1.5 à 2.5 x zoom optique). Lorsque cela est possible, assurer le champ de vision contient plusieurs processus de telle sorte que des mesures de dendrites de référence peut être obtenue, pour déterminer si non spécifique en raison de photoblanchiment acquisition se produit. </li><li> Réglez les filtres, sténopé, vitesse de balayage et de gain du détecteur afin de permettre fluorescence maximale de l&#39;excitation laser minimale, mais avec une saturation limitée. Un diamètre de trou d&#39;épingle grande est recommandé, afin de maximiser la collecte de photons (2 pm convient pour épines et les dendrites ternaires). Le gain du détecteur doit être assez fort pour déceler les petites augmentations de fluorescence,de telle sorte que les premières images, avant l&#39;photoblanchiment ne pas dépasser 10% de pixels saturés. </li><li> Enregistrer cette configuration doit être utilisé pour la pré-/ post-eau de Javel et les phases de récupération de l&#39;expérience. </li><li> Suivant définir les régions photoblanchiment; la sélection d&#39;un retour sur investissement pour le photoblanchiment initiale et des régions adjacentes de la phase de photoblanchiment répétitif ultérieure. S&#39;assurer que les régions adjacentes sont suffisamment larges pour empêcher la récupération par diffusion entre les balayages (typiquement 5 um, voir Fig. 2). </li><li> Ajustez les paramètres de l&#39;eau de Javel pour ROIs photoblanchiment à la fois. Le photoblanchiment initiale doit être rapide (0,1-0,5 sec) nécessitant entre 1-5 itérations, selon le zoom optique et le volume de la RI. Pour les régions adjacentes, l&#39;excitation laser doit être ajustée pour assurer photoblanchiment continue des régions flanquantes, mais sans dommage phototoxique. </li><li> À titre indicatif, nous utilisons une excitation laser à 100% pour le photoblanchiment initiale, et 10% pour le pH répétitif photoblanchimentase. </li></ol></li><li> L&#39;acquisition des images <ol><li> Une fois tous les paramètres ont été définis, à réaliser l&#39;expérience FRAP-FLIP comme une séquence d&#39;images time-lapse variable, décrites dans les 4 blocs ci-dessous: BLOC 1: 3-10 images de référence pré-blanchiment, à la puissance laser de faible, pas de délai BLOC 2: le retour sur investissement photoblanchiment centrale à la puissance du laser complète, 1-5 itérations BLOC 3: 3-10 images de relèvement post-blanchiment BLOC 4: photoblanchiment répétitive des régions flanquantes à la puissance du laser moyenne avec capture d&#39;image à un intervalle de temps typique de 1 - 5 secondes, selon le taux de récupération de la protéine à l&#39;étude. </li><li> Enfin, remplacer la solution d&#39;enregistrement extracellulaire avec une solution tamponnée à pH 6 d&#39;enregistrement contenant 140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM de MES (pour étancher la fluorescence) ou complétées avec 50 mM NH4Cl contenant 90 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,8 mM de CaCl 2, 0,8 mMMgCl 2, 20-25 mM d&#39;HEPES, pH 7,4 (pour révéler les protéines dans les magasins à bas pH intracellulaire), (voir Fig. 2). </li><li> Collecter au moins 10 à 20 ensembles de données pour chaque protéine recombinante, pour permettre une analyse statistique. Conditions d&#39;imagerie afin d&#39;éviter de biaiser les résultats, assurer sont maintenues conformément à travers répétitions. Se débarrasser de tout les ensembles de données lorsqu&#39;elles sont incomplètes blanchiment, une dérive importante du plan focal ou des dommages aux cellules phototoxique sont observées. </li></ol></li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Ouvrez les images avec le logiciel ImageJ. </li><li> Alignez les piles pour tenir compte des petites fluctuations dans le plan xy qui se sont produites tout au long de la série chronologique en utilisant le plugin Stackreg (plugins → → stackreg transformation: corps rigide → <ok> ). </ok></li><li> Pour les images prises sur le Zeiss confocal, utilisez le plugin Boîte à outils LSM de rapporter les valeurs de temps dans un fichier texte (plugins → LSM Boîte à outils → Voir LSM Boîte à outils → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ),et d&#39;importer ces valeurs dans une feuille de calcul d&#39;analyse. </apply></apply></li><li> Pour mesurer les fluctuations de fluorescence au cours de l&#39;expérience FRAP-FLIP, il faut diviser le segment photobleached dans les régions de pixels individuels (environ 20pixels) et de mesurer la fluorescence moyenne de ces ROIs à chaque point dans le temps (F). Pour obtenir rapidement ces valeurs, sélectionnez ROIs multiple en utilisant l&#39;outil d&#39;analyse de la ImageJ &#39;ROI gestionnaire (→ Outils → Analyser le retour sur investissement Manager) et un rapport de la fluorescence moyenne par pixel en utilisant le «Terrain de l&#39;axe Z profil» commande (Image → Stacks → Plot Z le profil d&#39;axe). </li><li> Répétez cette étape pour mesurer l&#39;intensité de fluorescence d&#39;un arrière-plan, la région non fluorescent. </li><li> Normaliser l&#39;intensité de fluorescence à chaque point dans le temps en soustrayant les valeurs de fond pour supprimer le bruit expérimental, et de diviser toutes les valeurs par la mesure de référence pré-blanchi moyenne. </li><li> Mesurer l&#39;intensité de fluorescence des zones adjacentes non-photobleached dendrites d&#39;évaluer le niveau de non-spécifiquephotoblanchiment lors de l&#39;acquisition. Correction pour la non-spécifique photoblanchiment est déconseillé pour l&#39;interprétation de «FRAP-FLIP» des données et devrait être évitée autant que possible. </li><li> Pour calculer si la reprise significative a eu lieu dans un retour sur investissement, il faut soustraire la moyenne des dernières mesures 5-10 de la séquence de la moyenne des premières mesures (5-10 AF) et de déterminer la signification statistique. Catégoriser le ROI de récupération et de non-récupération d&#39;évaluer le modèle de l&#39;exocytose (hotspots exocytose dire ou de récupération d&#39;arbre colonne vertébrale vs). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le résultat de type FRAP-FLIP expérience est montré dans la figure. 2. Ici, un neurone exprimant la sous-unité du récepteur AMPA GluA2 glutamate de type, étiqueté avec la SEP a été sélectivement photobleached le long d&#39;une région de dendrite. Fig 2.A illustre la région de dendrite qui a été photographié et indique le ROI qui ont été sélectionnés pour photoblanchiment (régions boîte blanche). The grande zone blanche en carton a été blanchi une fois, suivi par répétitif blanchiment des régions flanquantes en boîte, mis en évidence avec double tête flèches bleues. La flèche rouge indique le retour sur investissement mesuré, montré en fort grossissement dans les panneaux inférieurs. Fig 2.B, montre l&#39;intensité de fluorescence dans le retour sur investissement mesuré au cours du temps de l&#39;expérience. Dans cet exemple, une période de récupération a été enregistré une minutes après le photoblanchiment initiale pour permettre récepteurs écrus pour entrer dans le retour sur investissement par la diffusion latérale. Lorsque les régions flanquantes sont photobleached, le signal de fluorescence à partir de cette fraction fortement mobiles de récepteurs est occlus de la région centrale, et ceux de la région sont dilués à. L&#39;augmentation de la fluorescence (AF) ont observé au cours de la «FLIP» séquence peut donc être attribué à l&#39;insertion de SEP-GluA2 dans l&#39;arbre dendritique. Le lavage à faible pH et un pH de 7,4 + NH4Cl outre respectivement confirmer que la fluorescence mesurée est dérivée de la surfaceprotéines et révéler la proportion de protéines intracellulaires, séquestrés dans le retour sur investissement mesuré. Contrairement à FRAP, cette méthodologie de récupération isole en raison de l&#39;exocytose, aboutissant à un niveau considérablement réduit de recouvrement de fluorescence dans la région photobleached. Jusqu&#39;à présent, aucun modèle mathématique fiable a été développé pour s&#39;adapter et d&#39;analyser la reprise traces enregistrées en utilisant cette technique sélective de blanchiment. Il est cependant possible d&#39;adapter la trace de récupération avec une reprise mono exponentielle: F (t) = A s - Un e 0 (-t / τ) Où F (t) est la fluorescence au temps t, A, S est la valeur en régime permanent, A 0 est le décalage au temps 0, τ est la constante de temps. La croissance de recouvrement est fixé à un taux donné d&#39;atteindre un équilibre, correspondant à un état stable entre l&#39;insertion et la diffusion. Surtout, la constante de temps extraite de ce unnalyse ne reflète pas la constante de temps de l&#39;exocytose et ne peut être utilisé pour des traitements comparatifs pour une protéine individuelle. En outre, l&#39;évolution attendue des recouvrement de fluorescence est susceptible d&#39;être observé dans les sous-domaines le long de la région photobleached. Analyse du retour sur investissement dans un segment de petite photobleached peut être essentiel pour révéler l&#39;exocytose &quot;points chauds&quot; et il est conseillé d&#39;analyser les régions de longueurs comparables à celles de la variabilité de la densité de ces taches entre la dendrite aura une incidence sur le taux calculé. La figure 3 montre une extension de ce protocole, l&#39;application de la photoblanchiment de ROI grande partie avec des dendrites multiples dans le champ de vision, suivie par répétitif sélective de blanchiment d&#39;un seul dendrite. Cette approche permet traditionnelle «FRAP» et «FRAP-FLIP» des données devant être acquises en parallèle. Dans cet exemple, neurones de l&#39;hippocampe ont été infectées par une sous-unité du récepteur du glutamate de la classe kaïnate; SEP-étiqueté GluK2. Prior à l&#39;imagerie, ces neurones ont été traités avec des cylcohexamide (2h à 200μg/ml), pour bloquer la synthèse des protéines. En tant que tel, de recouvrement de fluorescence dans le ROI correspondant mesurée (figure 3.B) révèle que la proportion de la reprise en raison de la diffusion latérale et le recyclage dans la dendrite FRAP standard et le recyclage seul dans la dendrite soumis à la «FRAP-FLIP&quot; protocole. En comparant les valeurs Af à partir de courbes de récupération par rapport à la FRAP »FRAP-FLIP», les contributions relatives de recyclage (AF rec = 11,05%) par rapport à la diffusion latéraux (AF diff = 9,35%) peut être déduite. Contrairement à la figure 2, la reprise n&#39;est pas de maintenir un niveau stable, mais plutôt, en raison de l&#39;inhibition de la synthèse des protéines, montre une augmentation transitoire et après débarquement dans le signal, ce qui correspond à l&#39;épuisement de la piscine du récepteur disponible (environ baisse de 20% observée au cours de la période d&#39;enregistrement). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Figure 1. Schéma des principes de FRAP vs FRAP-FLIP protocoles Ce schéma illustre les résultats d&#39;un rapport régulier FRAP protocole un «FRAP-FLIP», en utilisant les tags SEP-récepteurs. Recouvrement de fluorescence dans le FRAP traditionnelle est indiquée sur le côté gauche. Mesuré recouvrement de fluorescence dans le centre ROI est attribuée à une combinaison de diffusion latérales f non-photobleached récepteurs SEP-étiqueté à partir de l&#39;extérieur de la ROI photobleached et l&#39;insertion des récepteurs à travers le recyclage et / ou de novo exocytose dans l&#39;arbre dendritique. En revanche, le photobleached répétitif du ROI d&#39;accompagnement illustré dans droite, montre comment cette mise à jour «FRAP-FLIP« protocole de récupération silences due à la diffusion latérale. En tant que tel, toute récupération de fluorescence mesurée peut être attribuée à une insertion directe dans le retour sur investissement. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Figure 2.Insertion de SEP-GluA2 dans la membrane plasmique sur l&#39;arbre dendritique A) Un neurone hippocampique exprimer SEP-GluA2, sélectivement photobleached long d&#39;une région de la dendrite. Le schéma illustre la région de dendrite qui a été imagée, tandis que le panneau supérieur gauche met en évidence le ROI qui ont été sélectionnés pour photoblanchiment. La grande zone blanche en carton a été blanchi une fois, suivi par répétitif blanchiment des régions flanquantes en boîte, mis en évidence avec double tête flèches bleues. Ce panneau montre la dendrite avant photoblanchiment. La flèche rouge indique le retour sur investissement mesuré, montré en fort grossissement dans les panneaux inférieurs. B) montre l&#39;intensité de fluorescence dans le retour sur investissement mesuré au cours du temps de l&#39;expérience, représentée en niveau de gris dans le retour sur investissement (non normalisée). La flèche noire mettre en évidence le point de temps de l&#39;agent de photoblanchiment initiale et flèche verte indique le début de la photoblanchiment répétitif. AF indique èmeaugmentation de la fluorescence e observée au cours de la période de récupération, due à l&#39;insertion de la SEP-GluA2 dans l&#39;arbre dendritique. Après un pH faible et un pH de 7,4 + lavages de NH 4 Cl confirmer que la fluorescence recouvrée se rapporte à la surface des récepteurs exprimés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Figure 3. Recyclage &amp; latérale Recyclage vs diffusion de SEP-GluK2 sur l&#39;arbre dendritique après le traitement cyclohexamide A) Un neurone hippocampique exprimer SEP-GluK2, de manière sélective avec photobleached FRAP parallèle et protocoles de récupération »FRAP-FLIP» effectuées le long ROIs dendritique séparée. Ce neurone a fait l&#39;objet d&#39;un prétraitement avec cyclohexamide, pour bloquer la synthèse des protéines (2 heures à 200 pg / ml). Le schéma illustre la région de dendrite qui a été imagée, tandis que le panneau de gauche mettant en évidence le ROI qui ont été sélectionnés pour photoblanchiment. The grande zone blanche en carton a été blanchie fois, suivie par répétitif de blanchiment des régions flanquant en boîte, de la partie inférieure de dendrites que, mis en évidence avec doubles dirigés flèches bleues. Ce panneau montre les dendrites avant photoblanchiment. Les flèches rouges souligner le ROI indiqué dans un fort grossissement en B) illustrant le recouvrement de fluorescence dans le FRAP traditionnel et le protocole du «FRAP-FLIP». Les comparaisons des niveaux d&#39;intensité de fluorescence dans le stade tardif de la récupération (panneaux tiers) montrent la contribution de la diffusion latérale et le recyclage par rapport recyclage seul. C) montre l&#39;intensité de fluorescence dans le ROI mesuré au cours du temps de l&#39;expérience, représentée en intensité normalisée les valeurs. La flèche noire mettre en évidence le point de temps de l&#39;agent de photoblanchiment initiale et flèche verte indique le début de la photoblanchiment répétitif. AF rec indique la reprise passagère due au recyclage des récepteurs, déterminée à partir de la dendrite FRAP / FLIP tout AFdiff mesure la contribution de la diffusion latérale de la SEP-GluK2 dans l&#39;arbre dendritique dans le «FRAP seulement&quot; retour sur investissement. L&#39;augmentation transitoire est suivie d&#39;un déclin progressif du signal, correspondant à la course vers le bas de récepteurs disponibles à la suite du traitement cyclohexamide. Le pH ultérieure faible et un pH de 7,4 + lavages de NH 4 Cl confirmer que la fluorescence recouvrée se rapporte à la surface des récepteurs exprimés.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous décrivons une stratégie novatrice de visualiser les composants de la traite plasma protéine de la membrane. L&#39;approche combinatoire de photoblanchiment techniques avec des protéines SEP-étiqueté permet sélectivement les événements plasma membrane d&#39;insertion à être évaluée. En permanence photoblanchiment des protéines membranaires dans des régions adjacentes lors de la récupération, la méthode du «FRAP-FLIP» évalue la contribution du trafic vésiculaire à la récupération de fluorescence. Cette nouvelle approche permet l&#39;enregistrement direct de l&#39;insertion des protéines membranaires, permettant à la fois le nombre de sous-compartiments dont le recouvrement est observé et l&#39;amplitude de la reprise (AF) à l&#39;état stationnaire à déterminer. En outre, la comparaison de PAF avec et sans FLIP permet la proportion de recouvrement attribuable à la diffusion latérale à être calculée. En outre, dans la même expérience, les régions de non-photobleached dendrite adjacente aux régions flanquantes photobleached peut êtreune évaluation qualitative lors de la reprise, la perte de fluorescence observée dans ces régions sera en raison de la diffusion latérale des récepteurs photobleached dans ces segments non-photobleached de la dendrite. Ce protocole sélective photoblanchiment peut être utilisée pour étudier une variété de processus cellulaires tels que le trafic caractérisant excocytosis dans la membrane plasmique dans les sous-zones définies (par exemple, les dendrites ou épines) FRAP ou d&#39;évaluer la contribution de l&#39;insertion de diffusion vs latérale en effectuant en parallèle et des FRAP -FLIP »le long des dendrites protocoles adjacents (Fig. 3). De toute évidence, tandis que les directives spécifiques ont été présentés, chaque laboratoire devra optimiser les paramètres d&#39;imagerie selon les spécimens spécifiques et des équipements. Important, tous les récepteurs de surface dans la ROI doivent être photobleached, indépendante du plan z-axe focal, mais sans endommager phototoxique significative ou non spécifique photoblanchiment. NousERS devrait faire preuve de prudence lorsque l&#39;on tente ce protocole à le corps cellulaire, comme le pourcentage élevé de compartiments intracellulaires de pH relativement faible se traduit généralement par fluorescence de fond élevé dans ces régions. En outre, tandis que nous avons montré comment cette technique peut être appliquée de diverses manières, avant de commencer les expériences de photoblanchiment sélectifs sur une nouvelle SEP-étiqueté de construire, nous vous informons que la caractérisation initiale des récepteurs marqués est d&#39;abord menée, tel que décrit par Ashby et al 2. Dans l&#39;ensemble, cette méthode est une adaptation puissante et polyvalente du protocole FRAP standard, permettant des événements d&#39;insertion dans la membrane plasmique à être évalués en temps quasi réel.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nom du réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaires (optionnel)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Des lamelles de verre 24mm</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-L-lysine</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml dans du tampon borate à lamelles manteau</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Moyen Neurobasal</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% en placage neuronale et d&#39;alimentation moyenne</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptomycine Pénicilline</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; Moyenne 1% en placage neuronale et l&#39;alimentation</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-glutamine</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2 mM / 0,8 mM dans le placage / alimentation moyennes</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sérum de cheval</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% dans les médias de placage neuronales ne</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Psin ReP5 vecteur de clonage</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Pour la production de virus Sindbis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META confocale système</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Image J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<tdLogiciel&gt; libre accès. Tous les plugins décrits ci-après sont disponibles à<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"Les protéines membranaires&gt; tels que les récepteurs et canaux ioniques subir le trafic actif dans les neurones, qui sont très polarisé et morphologiquement complexe. Ce trafic dirigé est d&#39;une importance fondamentale pour fournir, maintenir ou éliminer les protéines synaptiques.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Super-écliptique pHluorin (SEP) est un dérivé sensible au pH de eGFP qui a été largement utilisé pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de protéines membranaires<sup&gt; 1-2</sup&gt;. À faible pH, la protonation de SEP diminue l&#39;absorption de photons et élimine l&#39;émission de fluorescence. Que les événements de trafic les plus intracellulaires se produisent dans des compartiments ayant un faible pH, où la fluorescence est éclipsé septembre, le signal de fluorescence à partir des protéines marquées SEP est principalement de la membrane plasmique, où le PES est exposée à un environnement à pH neutre extracellulaire. Lorsqu&#39;il est allumé à septembre de haute intensité, comme tous les colorant fluorescent, est irréversible photovieillissement (photobleached)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Il est important, car un faible pH étanche absorption d&#39;un photon, qu&#39;en surface exprimé SEP peut être photobleached tandis septembre intracellulaire n&#39;est pas affectée par l&#39;éclairage de haute intensité<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (retour de fluorescence après photoblanchiment) de SEP-protéines marquées est une technique pratique et puissant pour évaluer la dynamique des protéines à la membrane plasmique. Lorsque les protéines marquées par fluorescence sont photobleached dans une région d&#39;intérêt (ROI) la récupération de la fluorescence est due à la circulation des écrus protéines SEP-marqués dans la région blanchie. Cela peut se produire par l&#39;intermédiaire d&#39;une diffusion latérale et / ou de l&#39;exocytose des récepteurs non photobleached fourni soit par<em&gt; De novo</emSynthèse&gt; ou le recyclage (voir Fig. 1). La fraction de la protéine immobile et mobile peut être déterminée et la mobilité et de la cinétique de la fraction diffusible peut être interrogé dans les conditions basales et stimulées comme l&#39;application agoniste ou des stimuli d&#39;activation neuronale tels que NMDA ou KCl demande<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nous décrivons les techniques de photoblanchiment conçus pour visualiser la récupération sélective de la fluorescence due à l&#39;exocytose. En bref, un retour sur investissement est photobleached fois que les protocoles standard du PAF, suivie, après une brève reprise, par répétitif blanchiment des régions adjacentes. Ce protocole «FRAP-FLIP», développée dans notre laboratoire, a été utilisée pour caractériser le trafic des récepteurs AMPA à épines dendritiques<sup&gt; 10</sup&gt;, Et est applicable à un large éventail d&#39;études de trafic pour évaluer le trafic intracellulaire et l&#39;exocytose.</p

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Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Ce rapport décrit l&#39;utilisation de l&#39;imagerie des cellules vivantes et des techniques de photoblanchiment pour déterminer l&#39;expression de surface, les voies de transport et de la cinétique du trafic de manière exogène exprimé, sensible au pH GFP-protéines marquées à la membrane plasmique des neurones.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

82.9K vues.  University of Bristol. Ce rapport décrit l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes et des techniques de photoblanchiment pour déterminer l'expression de surface, les voies de transport et de la cinétique du trafic de manière exogène exprimé, sensible au pH GFP-protéines marquées à la membrane plasmique des neurones.

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de culture

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Recherche

Neurosciences

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Détermination des espèces d&#39;oxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Préparation de Synaptic membrane plasmique et de protéines de densité post-synaptique en utilisant un gradient discontinu de saccharose

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...