Nous tenons à remercier le Dr S. Ressler (Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Baylor College of Medicine) pour suggérer l&#39;utilisation de protéines de concentrateurs d&#39;augmenter la concentration de MMP dans les surnageants de culture cellulaire. Ce projet a été soutenu par des subventions du Fonds de Mme Clifford Elder Graham White de recherche dotées et le NIH / NIAMS (AR059838) à CB. Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.

1. Chargement et exécution du gel <ol><li> Tous les échantillons doivent être préparés de manière adéquate afin de maintenir la fonction des enzymes et utilisé immédiatement après la collecte ou conservés congelés à -80 ° C. Les échantillons ne doivent pas contenir d&#39;agents réducteurs (par exemple, une β-mercaptoéthanol) ou être bouillie avant le gel. </li><li> Ouvrir le sachet contenant un gel à l&#39;intérieur d&#39;une cassette, rincer la cassette avec de l&#39;eau déminéralisée. <ul><li> Retirer le ruban de protection de la partie inférieure de la cassette et le peigne du haut du gel. </li><li> Rincer les puits trois fois avec le tampon de fonctionnement (diluée à 1X dans de l&#39;eau déminéralisée). </li><li> Placer le gel dans la mini-cellule, assurant que le petit côté de la cassette visages vers l&#39;intérieur. Verrouiller en place avec le Wedge Tension Gel. La mini-cellule permet d&#39;exécuter un ou deux gels en parallèle. </li><li> Remplissez le haut (intérieur) de chambre avec 1X tampon courant au dessus du niveau des puits, vérifiez s&#39;il ya des fuites. En cas de fuite, éliminer le tampon et de repositionner le gel. </li><li> Remplir la chambre basse avec 1X tampon. </li></ul></li><li> Charge 10 uL du marqueur moléculaire de la protéine dans un puits. <ul><li> Mélanger une quantité égale de gel-tampon de chargement et de l&#39;échantillon et la charge dans les puits du gel en utilisant un gel des conseils de chargement (changé entre chaque échantillon). Ces puits peuvent être chargés avec un maximum de 20 uL totale. </li></ul></li><li> Placer le couvercle sur la cellule et de mini-connecter les cordons d&#39;électrode à l&#39;alimentation. Mettre l&#39;alimentation sous tension et réglez-le fonctionner à 125 V constante pendant 90 minutes. Vérifiez la formation de petites bulles sur le fil de la chambre basse, indiquant la circulation du courant. </li><li> Lorsque vous exécutez votre premier gel, de suivre les progrès de la migration toutes les 15 minutes, en utilisant le bleu de bromophénol inclus dans le tampon de chargement comme un indicateur. Laissez le long de gel jusqu&#39;à ce que le colorant indicateur atteint le bas du gel. </li></ol> 2. Renaturation et de développement du gel <ol><li> Pour chaque gel, préparer 100 ml de tampon 1X renaturation et 200 mL de tampon de dénaturation, à la fois dans de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Lorsque le colorant bleu de bromophénol suivi atteint le bas du gel, interrupteur de l&#39;alimentation hors tension, ouvrez la cellule Mini-, et enlever le gel. Séparez les deux côtés de la cassette en utilisant le couteau gel (ou d&#39;une spatule de pesage). Couper un coin pour marquer la direction du gel. </li><li> Retirer délicatement le gel de la cassette et placer dans un récipient avec 100 ml de tampon de renaturation. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Retirer le tampon de renaturation et ajouter 100 ml de tampon pour développer le gel. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Retirez le tampon en développement et ajouter 100 ml de tampon plus de développement pour le gel. Incuber une nuit (16-18 heures) à 37 ° C. </li><li> Retirez le tampon en développement et rincer trois fois (5 minutes chacun) avec de l&#39;eau déminéralisée sous agitation douce à température ambiante. </li><li> Balayage du gel pour sauver le positionnement exact des bandes standards de protéines car elles deviendront moins ou pas visible après coloration du gel. </li><li> Tache le gel en ajoutant 20 mL de SimplyBlue Safestain au gel. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Retirez le SafeStain SimplyBlue et de-tacher le gel dans 100 mL ou plus d&#39;eau déminéralisée pendant une heure à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Pour de meilleurs résultats, remplacez l&#39;eau déminéralisée frais et incuber pendant une heure ou plus à température ambiante sous agitation douce. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Retirer délicatement le gel de l&#39;eau et le placer dans une feuille de plastique protectrice. </li><li> Analyser le gel avec une résolution de 300 dpi ou plus. Enregistrez l&#39;image au format TIFF (figure 1A). </li><li> Mesure des intensités groupe avec ImageJ (ou autre logiciel similaire). <ul><li> Ouvrez le fichier TIFF dans ImageJ (figure 1A). </li><li> Visualisez en noir et blanc en sélectionnant &quot;Image&gt;&gt; Type 8-bit&quot; (figure 1B). </li><li> Utilisez l&#39;outil de sélection rectangulaire aux lignes de la première bande, dessinant un rectangle au moins deux fois supérieure à ce qu&#39;elle est large (ce qui est une exigence de logiciels). </li><li> Appuyez sur &quot;1&quot; ou sélectionnez &quot;Analyser&gt; Gels&gt; Sélectionner la voie d&#39;abord» et la bande seront présentées. </li><li> Un nouveau rectangle apparaît, déplacez-le vers la bande suivante et sélectionnez «Analyser&gt; Gels&gt; Sélectionner ruelle à côté&quot;. Répétez jusqu&#39;à ce que toutes les bandes sont sélectionnés (figure 1B). </li><li> Appuyez sur &quot;3&quot; ou sélectionnez &quot;Analyser&gt; Gels voies&gt; Terrain&quot; pour générer le tracé le profil de chaque bande (figure 1C). </li><li> Utilisez la sélection de la ligne droite (devrait déjà être sélectionné automatiquement) pour tracer des lignes de base de sorte que le pic d&#39;intérêt est un espace entièrement clos. </li><li> Sélectionnez l&#39;outil baguette magique et cliquez à l&#39;intérieur de chaque pic pour le sélectionner. </li><li> Sélectionnez &quot;Analyser&gt; Gels pics&gt; Label&quot; pour obtenir une table avec la région pour chaque pic sélectionné. Ces données peuvent être tracées en tant que tels (F1D IGURE) ou peut être normalisée à la valeur d&#39;une bande choisie. Cette normalisation est particulièrement important lorsque la mise en commun des valeurs de plusieurs gels de reproduire pour déterminer la signification statistique des résultats. </li></ul></li></ol> 4. Les résultats représentatifs Nous montrons un gel à 11 puits chargés avec différents surnageants de culture cellulaire contenant différentes quantités de MMP-2 (figure 1A). L&#39;observation directe de ce gel montre des différences évidentes dans les concentrations de MMP-2 entre certains des puits. Par exemple, il est clair que les puits n ° 4 et 5 contiennent beaucoup plus que de la MMP-2 et n ° 11 ou même bien # 10. Pour la quantification objective des bandes, nous avons utilisé la densitométrie avec le logiciel ImageJ (figure 1B-D), confirmant une différence d&#39;environ 4 fois dans la MMP-2 et des montants compris entre 11 et # # puits 4 et 5 et une différence d&#39;environ 2 fois dans MMP-2 et des montants compris entre # 10 et # puits 4 et 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Détection de la MMP-2 par zymographie gélatine. Une image, scannée d&#39;un gel de gélatine. Nombre des puits sont indiqués en haut du gel. B, le gel de même que dans une montre en noir et blanc d&#39;une densitométrie. Chaque bande a été sélectionné avec un rectangle dans ImageJ. C, deux exemples de profils de densitométrie pour le gel représenté en A et B (bandes # 4 et # 11). Une ligne droite a été élaboré à la base de chaque pic de créer une zone fermée. D, Terrain des domaines de pointe pour le gel représenté en A et B avant (à gauche) et après (à droite) la normalisation de la densité de la bande n ° 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Ce chiffre montre comment zymographie peut être utilisé comme une technique semi-quantitative. Nous avons chargé des dilutions en série (les étapes de 1:1 dilutions) dans 7 puits consécutifs et mesuré la densité de la bande pour les deux pro-MMP-2 et MMP-2.

<ol>
	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

Nous avons démontré comment effectuer une analyse des zymographique MMP-2 dans les surnageants de culture cellulaire. La quantité d&#39;échantillon à charger sur un gel doit être déterminée empiriquement en fonction de l&#39;origine et la MMP d&#39;intérêt. Chargement trop peu va empêcher la détection pendant le chargement trop peut conduire à une saturation car il ya tellement seul substrat une protéase peuvent digérer dans le domaine de la bande. Si nécessaire, l&#39;échantillon peut être dilué dans de l&#39;eau déminéralisée avant de les mélanger avec le tampon de chargement ou le temps de développement peuvent réduire d&#39;une nuit à 4 heures. Il est également possible de concentrer les protéines dans une solution utilisant des concentrateurs (par exemple le numéro de catalogue Millipore UFC803024). Si les bandes restent à peine visible, il peut être nécessaire de développer les gels pour une plus longue période de temps, même jusqu&#39;à 48 heures. Lors de la préparation des échantillons à partir de surnageants de culture de tissus, il convient de noter que sérum de veau fœtal (et autres sérums) contient les MMP qui peuvent affecter les résultats. Pour cette raison, nous recueillons l&#39;ensemble de nos surnageants après culture dans un milieu sans sérum. Les lavages décrits aux paragraphes 2.9 et 2.10 du protocole sont nécessaires pour supprimer le fond coloration des bandes digérées. Fois plus de temps lavez va supprimer plus de fond, mais aussi de baisser la coloration du substrat à travers le gel. Si les temps de lavage plus long sont nécessaires, nous vous conseillons de balayage du gel de toutes les quelques heures pour choisir le scanner avec le meilleur contraste. Cette technique peut être utilisée pour détecter les autres MMPs. Par exemple, la MMP-9 peuvent être détectés sur des gels de gélatine, et aussi dans une moindre mesure de MMP-1, MMP-8 et MMP-13 que la gélatine n&#39;est pas leur substrat préféré. MMP-1 et MMP-13 sont les meilleurs détecté sur zymographie collagène tout en caséine est le substrat préféré pour la MMP-11 et permet également la détection de la MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 et MMP-13 9. MMP-7 (matrilysine) et collagénases (MMP-1 et MMP-13) sont difficiles à détecter quand il est présent à de faibles niveaux de la caséine ou des gels de gélatine. Ajout de l&#39;héparine à l&#39;échantillon au moment du chargement du gel améliore significativement la limite de détection de la MMP-7. Pour MMP-1 et MMP-13, l&#39;héparine doit être ajouté au gel après la course électrophorétique est déjà en cours 12. Depuis zymographie mesures d&#39;activité enzymatique après dénaturation et la renaturation des enzymes, il permettra de mesurer l&#39;activité de toutes les MMP présents dans l&#39;échantillon. Ce sont des enzymes, des pro-enzymes, les enzymes et lié à des inhibiteurs endogènes (par exemple, TIMP-2). Il est cependant possible de déterminer le niveau d&#39;activation de MMP dans l&#39;échantillon en comparant la densité de la bande de l&#39;enzyme active et de celle du pro-enzyme, ce qui aura un poids légèrement supérieur moléculaire. Zymographie n&#39;est souvent pas suffisante pour identifier une MMP. Comparaison du niveau de migration d&#39;un RPM avec connues standards de poids moléculaire ne l&#39;aide dans l&#39;identification, mais il convient de noter que certaines de ces normes contiennent un agent réducteur et que lorsqu&#39;ils sont utilisés dans des conditions non réductrices, ils peuvent indiquer des poids moléculaires différents 9. Une option consiste à charger une MMP solubles recombinantes sur le même gel que les échantillons d&#39;essai. Les MMP peuvent toutefois être associés à d&#39;autres protéines, induisant un changement de poids moléculaire apparent. Inhibiteurs de MMP sélectifs peuvent être ajoutés au gel (ou partie d&#39;un coupé dans la moitié de gel) pendant l&#39;incubation dans un tampon de développement comme outils pharmacologiques à l&#39;identité de la MMP de interest.A seconde technique (Western Blot, immunocytochimie, ou ELISA) est recommandée pour aider à l&#39;identification de la MMP d&#39;intérêt. Il est à noter que les limites de détection pour Western Blot sont souvent bien inférieurs à ceux des gels zymographique, pouvant conduire à de faux résultats négatifs lors de l&#39;utilisation de cette technique.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

Les métalloprotéinases matricielles (MMP) sont des endopeptidases contenant du zinc. Ils dégradent les protéines par clivage des liaisons peptidiques. Plus de vingt MMP ont été identifiés et sont séparés en six groupes en fonction de leur structure et leur spécificité de substrat (collagénases, gélatinases, le type de membrane [MT-MMP], stromélysines, matrilysins, et autres). Les MMP jouent un rôle crucial dans l&#39;invasion cellulaire, la dégradation du cartilage, le remodelage des tissus, cicatrisation des plaies, et l&#39;embryogenèse. Ils participent donc à la fois dans les processus normaux et dans la pathogenèse de plusieurs maladies, telles que la polyarthrite rhumatoïde, le cancer ou maladie pulmonaire obstructive chronique 1-6. Ici, nous allons nous concentrer sur la MMP-2 (gélatinase A, collagénase de type IV), une MMP largement exprimé. Nous allons démontrer comment détecter la MMP-2 dans les surnageants de culture cellulaire par zymographie, une couramment utilisé, une technique simple, et pourtant très sensible d&#39;abord décrite en 1980 par C. Heussen et EB Dowdle 7-10. Cette technique est semi-quantitatif, il peut donc être utilisée pour déterminer les niveaux de MMP dans les échantillons de test lorsque les concentrations de MMP connus recombinant sont chargés sur le même gel 11. Les solutions contenant les MMP (par exemple, les surnageants de culture cellulaire, l&#39;urine ou le sérum) sont chargés sur un gel de polyacrylamide contenant du sulfate de sodium dodécyl (SDD; pour linéariser les protéines) et de la gélatine (substrat pour MMP-2). Le tampon de l&#39;échantillon est conçu pour augmenter la viscosité de l&#39;échantillon (pour faciliter le chargement du gel), fournissent une teinture de suivi (bleu de bromophénol, à surveiller la migration de l&#39;échantillon), fournir des molécules dénaturant (pour linéariser les protéines), et de contrôler le pH de l&#39;échantillon. Les protéines sont alors autorisés à migrer sous un courant électrique dans un tampon de migration conçu pour fournir un taux de migration constante. La distance de migration est inversement corrélée avec le poids moléculaire de la protéine (petites protéines se déplacer plus rapidement à travers le gel de protéines de grande taille et donc ne migrent plus loin dans le gel). Après migration, le gel est placé dans un tampon de renaturation des protéines pour permettre de retrouver leur structure tertiaire, nécessaires à l&#39;activité enzymatique. Le gel est ensuite placé dans un tampon de développement conçu pour permettre à la protéase à digérer son substrat. Le tampon contient également le développement p-aminophénylmercurique acétate (AFPA) pour activer le non-protéolytiques pro-MMP en MMP actives. La prochaine étape consiste à coloration du substrat (gélatine dans notre exemple). Après le lavage l&#39;excès de colorant hors gel, les zones de la digestion de protéase apparaissent comme des bandes claires. Le plus clair de la bande, le plus concentré de la protéase qu&#39;il contient. Intensité de coloration de bande peut alors être déterminée par densitométrie, en utilisant un logiciel tel que ImageJ, permettant une comparaison de l&#39;échantillon.

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Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Ce protocole décrit une analyse basée sur les activités de détection des métalloprotéinases matricielles dans les surnageants de culture ou de fluides corporels.

Détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelle par zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

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Research

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83.5K vues.  Baylor College of Medicine. Ce protocole décrit une analyse basée sur les activités de détection des métalloprotéinases matricielles dans les surnageants de culture ou de fluides corporels.

Vidéo: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Recherche

Biologie

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Détection de Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 par les cellules PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

La détection des protéines liant l&#39;ARN par<em&gt; In vitro</em&gt; ARN Pull-down en adipocytes Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.