Nous remercions le ministère de la Sécurité intérieure des États-Unis pour fournir une partie du financement.

Une. Souches bactériennes et Modèle Préparation ADN <ol><li> Cultiver des souches bactériennes de E. coli O157: H7, non-O157, et d&#39;autres espèces pathogènes comme Salmonella et Shigella, à 37 ° C pendant une nuit sous agitation. </li><li> Extraire l&#39;ADN à partir de cultures bactériennes en utilisant le kit approprié (voir tableau des matériaux) et en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Mesurer la densité optique (OD 260) pour déterminer les concentrations d&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. </li></ol> 2. Primer et conception de la sonde pour le test qPCR <ol><li> E. coli O157: H7 sont des séquences de numéro d&#39;accession GenBank AE00517411. amorces de conception et sonde en utilisant un logiciel approprié pour l&#39;amorce et la conception de la sonde pour la PCR en temps réel (voir le tableau des matériaux pour plus de détails). Les séquences des amorces et la sonde sont les suivantes: Z3276-avant (F) 5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276-marche arrière (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li> Reconstituer la poudre d&#39;apprêt à l&#39;eau, résultant en une concentration de 10 uM en tant que solution de travail de l&#39;amorce. </li><li> Diluer les sondes à 10 uM en tant que solutions de travail de la sonde. Les sondes marquées varient en puissance avec des lots. Par conséquent, titrer chaque lot de sondes marquées avant d&#39;utiliser pour des performances optimales qPCR. </li></ol> 3. Réglage des qPCR Conditions de l&#39;essai <ol><li> Préparer le mélange de réaction, qui se compose de 25,0 pi de 2x en temps réel par PCR Master Mix, 200 nM d&#39;amorce directe, 200 nM d&#39;amorce inverse, et 100 nM de sonde. </li><li> Ajouter 5 ul de l&#39;ADN de l&#39;échantillon (100 pg) et un volume approprié d&#39;eau pour atteindre un volume final de 50 ul. </li><li> Pour un contrôle sans modèle, utiliser 5 pi d&#39;eau pour remplacer l&#39;échantillon d&#39;ADN. </li><li> Définir les conditions de qPCR comme suit: 95 ° C pendant 10 minutes pour l&#39;activation de TaqMan, suivie de 40 cycles de 95 ° C pendant 10 secondes pour la dénaturation et 60 et# 176; C pendant 1 minute pour l&#39;hybridation / extension. </li></ol> 4. qPCR test de sensibilité <ol><li> Faire une série de dilution de 10 fois à partir d&#39;une culture de milieu de la phase exponentielle (DO600 = 0,5; environ 1,5 x 10 8 CFU / ml par placage). </li><li> Ajouter 100 ml de dilutions de cellules sur une plaque à 96 puits en triple. </li><li> Centrifuger la plaque à 2500 g pendant 10 min. </li><li> Ajouter 50 ml de solution d&#39;extraction de l&#39;ADN dans chaque puits. </li><li> culots cellulaires d&#39;Remettre en suspension avec une pipette à canaux multiples. </li><li> Sceller la plaque avec un film, faire bouillir la plaque dans un bain d&#39;eau pendant 10 min, et centrifuger à 2500 g pendant 2 min. </li></ol> 5. Préparation des mélanges vivants et morts cellulaires pour le traitement de PMA <ol><li> Développez 10 ml de E. coli O157: H7 à 37 ° C jusqu&#39;à la phase semi-exponentielle de la culture et de diviser en deux parties aliquotes. </li><li> Faire bouillir une fraction aliquote de cellules pendant 10 min dans un bain d&#39;eau pour les cellules mortes et laisser l&#39;autre portion aliquote de cellules vivantes. </li><li> Vérifiez lare n&#39;y a pas de cellules vivantes de l&#39;aliquote tué par la chaleur par l&#39;étalement des cellules sur des plaques d&#39;agar LB. </li><li> Prendre 2 ml des cellules vivantes et tuées par la chaleur et d&#39;ajuster la concentration de 8 x 10 6 UFC / ml avec du milieu LB. Créer quatre séries de dilutions de cellules allant de 8 x 10 0 à 8 x 10 6 UFC / ml. </li><li> Utilisez les deux premières séries de dilutions de cellules pour des cellules vivantes traitées avec de la PMA ou non traitée. </li><li> Pour les troisième et quatrième séries de dilutions de cellules, ajouter 8 x 10 6 cellules mortes pour chaque dilution de la cellule (8 x 10 0 - 8 x 10 6) de faire des mélanges de cellules vivantes et mortes. </li><li> Traiter la troisième série de dilution avec du PMA et utiliser la quatrième série de dilution pour le contrôle. </li></ol> 6. Le traitement des cellules avec de la PMA <ol><li> Dissoudre PMA dans le diméthylsulfoxyde (ou l&#39;eau) pour obtenir une solution 10 mM d&#39;actions et stockés à -20 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Aliquote de 400 ul de cellules vivantes, les cellules mortes, et le mélange de cellules vivantes et mortes danstrois microtubes séparés. </li><li> Ajouter 2,0 ml de PMA 10 mM à chaque aliquote de cellules à une concentration finale de 50 uM. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min dans l&#39;obscurité, en secouant doucement plusieurs fois, trois secondes à chaque fois. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;échantillons d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Sceller la plaque avec un film optique et mettre la plaque sur la glace. </li><li> Placer la plaque de 20 cm d&#39;une source de lumière W 650 d&#39;halogène et exposer pendant 2 min pour exposition à la lumière. </li><li> Centrifuger la plaque à 2500 g pendant 10 min, jetez doucement le surnageant et égoutter la plaque sur un morceau de papier absorbant soigneusement. </li><li> culots cellulaires d&#39;Remettre en suspension dans 50 ul de solution d&#39;extraction de l&#39;ADN par pipetage de haut en bas vingt fois avec un multi-canal Pipetman. </li><li> Sceller la plaque avec un film, faire bouillir pendant 10 min dans un bain d&#39;eau, et centrifuger à 2500 g pendant 2 min. Le surnageant de la plaque est de l&#39;ADN à partir de cellules traitées avec du PMA et prêt pour la qPCR. </li><li> Effectuer qPCR que descrilit au-dessus, en utilisant 5 ul d&#39;ADN. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).</li><li>Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+strains+of+Escherichia+coli+serotype+O157:H7+and+their+Shiga-like+toxin+type+by+mismatch+amplification+mutation+assay-multiplex+PCR.">Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).</li><li>Li, Y., Mustapha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7,+Salmonella,+and+Shigella+in+apple+cider+and+produce+by+a+multiplex+PCR.">Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR.</a> J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+in+virulence+patterns+of+Escherichia+coli+possessing+eae+genes.">Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes.</a> Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).</li><li>Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. 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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. 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Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Un objectif principal de l&#39;étude implique l&#39;utilisation d&#39;un Z3276 ORF, un unique E. coli O157: H7, en tant que biomarqueur pour une seule analyse qPCR. À l&#39;heure actuelle, la plupart des analyses qPCR ciblent des gènes de virulence, comme stx1, stx2, et eaeA 1,2,5,6 ou gènes phénotypiques communs, comme uid 3,4, rfbE et gènes fliC 8,9. De temps en temps, une espèce ou une souche ne peuvent pas être identifiés définitivement par le gène (s) de virulence, tels que stx 1 et stx deux gènes, comme les gènes sont présents dans différentes espèces ou souches 16 ainsi. Utilisation rfbE et fliC de gènes cibles, les deux gènes sont nécessaires pour être utilisé pour l&#39;identification complète 17. Utilisation ORF Z3276 en tant que biomarqueur, ce dosage qPCR a été démontrée comme étant dosage sensible et spécifique (tableau 1). Ce test a été soumis à inclusivité et l&#39;exclusivité des tests rigoureux, y compris O157: H7 (n = 367), plus de 100 souches non-O157, et d&#39;autres espèces pathogènes comme Salmonella et Shigella. Tous O157: H7 ont été examinés de façon positive détectés, et pas de réactivité croisée n&#39;a été trouvée à partir des souches non-O157 (tableau 1), ce qui indique que l&#39;ORF Z3276 est un biomarqueur unique et forte pour la détection de E. coli O157: H7. L&#39;autre objectif de l&#39;étude est de détecter sélectivement les cellules vivantes des cellules mortes par traitement au PMA avant extraction de l&#39;ADN. PMA peut pénétrer dans les cellules mortes de la membrane est compromise et la lier à l&#39;ADN et inhibe ainsi l&#39;amplification de l&#39;ADN des cellules mortes dans les 13 PCR. Nous avons modifié la procédure PMA-traitement, et adapté à un format de plaque à 96 puits pour la procédure. L&#39;intensité droit de exposition à la lumière est essentielle pour obtenir un effet optimal réticulation. Auparavant, les microtubes ont été utilisés dans cette étape de 13 à 15. Cependant, microtubes séparés sont difficiles à manipuler dans l&#39;ex lumièrel&#39;étape de Posure, et ces tubes ne sont pas absolument transparent pour obtenir le meilleur goût transversale. En utilisant une plaque de 96 puits, nous avons amélioré l&#39;efficacité de la PMA-traitement. Ces modifications peuvent influer sur le dosage de plusieurs façons: ils rendent plus facile d&#39;obtenir un effet de réticulation complète et uniforme, en particulier avec de nombreux échantillons, les échantillons traités peuvent être déplacés d&#39;une plaque à l&#39;autre pour rendre possible la détection d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons, et ils offrent ce test PMA-qPCR avec un potentiel d&#39;automatisation pour l&#39;ensemble du processus. La limitation de ce dosage PMA-qPCR est que le traitement augmente le coût du PMA de PCR et légèrement réduit quelque peu la sensibilité du dosage par PCR.

La PCR est une technique couramment utilisée pour la détection de E. coli O157: H7 dans les échantillons alimentaires et environnementaux. L&#39;identification de biomarqueurs spécifiques pour E. coli O157: H7 est l&#39;un des facteurs essentiels pour la détection de succès dans des essais de PCR. Les biomarqueurs couramment utilisés dans des essais de PCR pour la détection de E. coli O157: H7 comprennent des toxines Shiga (stx 1 et stx 2) 1,2, 3,4 uidA, eaeA 5,6, rfbE 7, et fliC gènes 8,9. Ces marqueurs peuvent fournir une efficacité variable pour l&#39;identification, mais la plupart des marqueurs biologiques ne peuvent être utilisés en tant que biomarqueur unique pour la détection de E. coli O157: H7. Cette insuffisance de la puissance de la différenciation des gènes cibles nécessite biomarqueur (s) plus précis et plus fort pour l&#39;identification de E. coli O157: H7 10. De nombreuses sondes pour les gènes hypothétiques ou des cadres de lecture ouverts (ORF) dans E. coliO157: H7 11 ont été conçus pour qPCR analyse sur la base des indices de puces ADN de génotypage de notre laboratoire et par la recherche dans la base de données GenBank du Centre national d&#39;information sur la biotechnologie. La séquence de l&#39;ORF Z3276, qui est un gène fimbriae 11, a été choisi pour l&#39;analyse qPCR. Par la suite, un test PCR quantitative a été développé par le biais de nombreux essais sur les paramètres de la PCR tels que les concentrations des amorces et des sondes, ainsi que les températures d&#39;hybridation et d&#39;extension (données non présentées). Après inclusivité d&#39;incitation et d&#39;exclusivité des tests sur les souches de référence tels que E. coli O157: H7, non-O157 et Shigella dans la qPCR, l&#39;ORF Z3276 a été identifié comme un marqueur génétique spécifique et forte pour l&#39;identification de E. coli O157: H7. Ensuite, nous développons une nouvelle méthode qPCR utilisant ce biomarqueur unique pour l&#39;identification de E. coli O157: H7. Un autre défi pour la détection de E. coli O157: H7 dans contaminé foods et de l&#39;environnement est une détermination précise des cellules vivantes à partir d&#39;échantillons. La présence prolongée de l&#39;ADN des cellules mortes et l&#39;incapacité de différencier viabilité en PCR pourrait causer des lectures faussement positifs, à une surestimation du nombre de cellules vivantes dans la détection. Par conséquent, ce qui limite l&#39;utilisation de PCR dans la détection précise de pathogènes d&#39;origine alimentaire 12. Une nouvelle approche pour différencier l&#39;ADN des cellules mortes a été pris en combinant propidium monoazide (PMA) un traitement à la procédure PCR au cours des dernières années 13-15. La PMA est capable d&#39;aller à l&#39;intérieur des cellules mortes, et s&#39;intercaler dans l&#39;ADN lors de l&#39;exposition à la lumière, mais elle ne peut pas aller à l&#39;intérieur de cellules vivantes à réagir avec l&#39;ADN des cellules vivantes. Ainsi, dans des mélanges PMA-traités de cellules vivantes et mortes, l&#39;ADN des cellules mortes ne peut pas être amplifiée par PCR en 13. Nous avons combiné le traitement PMA avec le test qPCR nouvellement développé pour détecter sélectivement en direct E. coli O157: H7 cellules. De plus, nous avons fait le PMA-qPCR uneéssayé possible pour la détection à haut débit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

Un cadre de lecture ouverte unique (ORF) Z3276 a été identifié comme un marqueur génétique spécifique de E. coli O157: H7. Un essai qPCR a été développé pour la détection de E. coli O157: H7 en ciblant ORF Z3276. Avec ce dosage, on peut détecter aussi peu que quelques copies du génome de l&#39;ADN de E. coli O157: H7. La sensibilité et la spécificité du test ont été confirmés par des tests de validation intensifs avec un grand nombre de E. coli O157: H7 souches (n = 369) et des souches non-O157 (n = 112). En outre, nous avons combiné propidium monoazoture (PMA) avec la procédure de protocole de qPCR nouvellement développé pour la détection sélective de cellules vivantes à partir de cellules mortes. L&#39;amplification de l&#39;ADN à partir de cellules mortes PMA-traitées a été presque complètement inhibée par opposition à l&#39;amplification de l&#39;ADN pratiquement pas affecté par les cellules vivantes traitées au PMA. En outre, le protocole a été modifié et adapté à un format de plaque à 96 puits pour une manipulation facile et uniforme d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons. Tsa méthode devrait avoir un impact sur microbiologique précis et la surveillance épidémiologique de la sécurité alimentaire et la source de l&#39;environnement.

La détection de E. coli O157: H7 par qPCR utilisant ORF Z3276 L&#39;un des facteurs clés de cette analyse est la sensibilité et la spécificité de la sonde Z3276 utilisé dans la qPCR. Il peut détecter aussi peu que quelques copies du génome de l&#39;ADN de E. coli O157: H7 comme représenté sur la Figure 1A. Sur les 120 souches non-O157 examinés, y compris les six grandes souches non-O157 STEC O104: souches, H4, Salmonella et souches de Shigella, aucune réactivité croisée n&#39;a été trouvée, comme indiqué dans le tableau 1. Combinaison du traitement PMA avec qPCR Incubation E. coli O157: H7 des cellules avec PMA (50 mM) pendant 5 minutes à l&#39;obscurité et l&#39;exposition à la lumière pendant 2 min ont été choisies pour des conditions de traitement au PMA. En outre, nous avons modifié PMA procédure de traitement. Par rapport aux différents micro-tubes transparents utilisés dans l&#39;étape de réticulation, une plaque de 96 puits a été trouvé pour être plus efficace d&#39;atteindre l&#39;effet de reticulation optimal et plus pratique que la manipulation d&#39;un grand nombre de tubes d&#39;échantillons au cours du processus d&#39;exposition à la lumière. Amplification de l&#39;ADN à partir de cellules vivantes et mortes PMA-traités dans qPCR Les effets de l&#39;inhibition médiée par le PMA de l&#39;amplification d&#39;ADN à partir de cellules mortes à ce dosage qPCR ont été présentés dans la figure 1 à l&#39;aide d&#39;ADN provenant de deux dilutions de 10 fois de cellules vivantes ou mortes série. Les résultats montrent que les courbes produites par les cellules vivantes traitées avec du PMA (courbe rouge) et sans PMA (courbe bleu) semblent linéaire et presque identique à une autre. Différences de valeurs de CT légères ont été montrées entre les cellules vivantes traitées avec du PMA et sans PMA (Figure 1A), ce qui suggère que le traitement de PMA a peu d&#39;effet sur ​​l&#39;amplification de l&#39;ADN des cellules vivantes dans la qPCR. Mais un 15 - différence de valeur de CT (32000 fois) a été montré entre les cellules mortes traitées avec du PMA et sans PMA, démonstrating que le traitement PMA supprimée efficacement l&#39;amplification d&#39;ADN à partir des cellules mortes (figure 1B). Détection de cellules vivantes à partir de mélanges de cellules vivantes et mortes dans qPCR Deux séries de dilutions de cellules vivantes (8 x 10 0 - 8 x 6 10 UFC) ont été traités avec de la PMA ou sans PMA pour détecter les cellules vivantes de morts mélanges live / cellulaires. Les résultats de qPCR (figure 2A) ont démontré une tendance progressive inverse parallèle de valeurs CT comme liée au nombre de cellules vivantes traitées (barres pourpres) aux échantillons non traités (barres bleues). Les cellules vivantes traitées ont donné des valeurs de CT d&#39;un peu plus élevées que celles de cellules vivantes non traités. Une tendance progressive inverse similaire dans les valeurs CT a été observée avec le nombre réel de cellules vivantes dans les mélanges morts vivants / cellulaires traitées avec de la PMA (barres vertes) ainsi que dans la figure 2B. En outre, cette tendance à la baisse des valeurs de CT étaitobservé avec le nombre de cellules vivantes dans les mélanges en dépit de la présence de 106 cellules mortes. Ces résultats ont montré que les valeurs de CT des mélanges vivants / morts cellulaires représentent l&#39;ADN des cellules vivantes seulement, alors que l&#39;amplification de l&#39;ADN des cellules mortes a été efficacement supprimée par traitement au PMA. Mais, les valeurs de CT de mélanges vivants / morts cellulaires traitées avec du PMA ont fluctué et n&#39;ont pas reflété les nombres de cellules vivantes dans les mélanges de la figure 2B (barres jaunes). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> Figure 1. Vivent et les cellules mortes traitées avec de la PMA ou sans PMA dans l&#39;essai qPCR. (A) Une série de 10 fois dilué direct E. coli O157: H7 dilutions cellulaires (8 x 10 0 - 8 x 10 6 UFC) ont été traités avec de la PMA ou sans PMA.Les valeurs CT représentent les valeurs CT moyennes des trois exemplaires dans l&#39;essai qPCR. (B) Comparaison de l&#39;amplification d&#39;ADN de cellules vivantes et les cellules mortes traitées avec du PMA et sans PMA dans la comparaison de q essai qPCR. ARn se réfère à la fluorescence changement d&#39;intensité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> Figure 2. La différenciation des cellules vivantes à partir de mélanges vivants / morts cellulaires par PMA-qPCR Quatre séries de dilutions de 10 fois de cultures de cellules (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU). Ont été effectués comme indiqué. (A) Première série de dilution des cellules a été traitée avec du PMA pendant la deuxième dilution cellulaire était ou non traitée avant l&#39;extraction de l&#39;ADN.(B) 8 x 10 6 cellules mortes ont été mélangés avec les troisième et quatrième séries de dilutions de cellules pour effectuer deux séries de mélanges vivants / morts cellulaires comme indiqué. Une série de mélanges de cellules a été traitée avec du PMA et de l&#39;autre ensemble a été traité sans PMA avant l&#39;extraction de l&#39;ADN. Chaque barre représente les valeurs de CT moyen d&#39;une expérience triple ± SD. <table><tbody><tr><td> Organisme </td><td> Sérotype </td><td> Nombre de souches testées </td></tr><tr><td rowspan="15"> E. coli </td><td> 2006 épinards O157: H7 isolats de </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 Taco Bell O157: H7 isolats </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 Taco John O157: H7 isolats </td><td> 11 </td></tr><tr><td> collections de souches de DMB de l&#39;autre O157: H7 </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Autre </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Salmonella </td><td> Typhi </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Newport </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella dysenteriae </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> Inconnu </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Shigella boydii </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Total </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> Tmesure 1. souches utilisées pour la validation de PCR en temps réel pour l&#39;identification de E. coli O157: H7.

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Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Une analyse qPCR est développé pour la détection de Escherichia coli O157: H7 de cibler un marqueur génétique unique, Z3276. La qPCR a été combiné avec propidium monoazide (PMA) de traitement pour la détection de cellules vivantes. Ce protocole a été modifié et adapté à un format de plaque à 96 puits pour une manipulation aisée et uniforme de nombreux échantillons

Détection de Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 par les cellules PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

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Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.5K vues.  Food and Drug Administration.  Une analyse qPCR est développé pour la détection de Escherichia coli O157: H7 de cibler un marqueur génétique unique, Z3276. La qPCR a été combiné avec propidium monoazide (PMA) de traitement pour la détection de cellules vivantes. Ce protocole a été modifié et adapté à un format de plaque à 96 puits pour une manipulation aisée et uniforme de nombreux échantillons 

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An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test pour mesurer l&#39;activité des Escherichia coli Inductible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

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Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Et<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocoles pour la mise en œuvre d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sur la base du système d&#39;expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation