Confocale images ont été obtenues à l&#39;Université de l&#39;Iowa Carver Centre d&#39;Imagerie. Le financement a été fourni par une subvention SBIR (MH079805) à BF soutien supplémentaire pour la reproduction des souris pour ce projet a été fourni par NIDCD (5R01DC00559007) au BF

<ol>
	<li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes.">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li><li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing.">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li><li>Bartheld, C. S. v. o. n., Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+tracing+with+DiI:+decalcification,+cryosectioning,+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li><li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection.">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice.">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li><li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea.">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li></ol>

Souris tissus ont été recueillis en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université de l&#39;Iowa Soins des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation (ACURF 0804066).

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour combiner quatre techniques en vue de maximiser la collecte des données et la cohésion en corrélant les données au sein d&#39;un animal donné (figure 3). Cette approche permettra de réduire le montant de l&#39;élevage et donc du temps nécessaire pour obtenir des données publiables, tout en améliorant l&#39;information sur la co-localisation et des effets corrélatifs de mutants. Bien que les souris embryonnaires ont été utilisées dans cette vidéo, souris adultes ainsi que d&#39;autres animaux comme le poulet, xénope, poisson zèbre et peuvent être analysés en utilisant ces techniques aussi bien. Lors de l&#39;utilisation d&#39;autres espèces protéinase K digestion peut être nécessaire de modifier. Ici, nous utilisons différents colorants fluorescents NeuroVue spécifiquement l&#39;étiquette jusqu&#39;à trois populations de neurones d&#39;intérêt. L&#39;avantage de ces colorants est qu&#39;elles peuvent être utilisées dans des souris mutantes, qui peut être problématique lorsque s&#39;appuyant uniquement sur ​​l&#39;immunohistochimie qui peuvent ou peuvent ne pas être affectés par les mutations à analyser, et ils l&#39;étiquette neurones rétrograde et anterogradely 5. Une étude récente a également augmenté le nombre de populations de neurones qui peuvent être étiquetés simultanément à six 2. Après, le colorant lipophile traçage du même tissu d&#39;intérêt peuvent alors être analysés en utilisant l&#39;hybridation in situ, pour l&#39;analyse de la transcription du gène et peuvent être ensuite analysées par immunohistochimie pour la distribution des protéines. Cette dernière analyse peut être complétée par l&#39;histologie détaillée qui peut ajouter à la caractérisation phénotypique 6. Cette analyse multifactorielle a le potentiel d&#39;acquérir de nouvelles connaissances à travers l&#39;analyse corrélative au sein du même animal qui pourrait autrement être improbable ou moins dans le besoin de protocoles plus vaste et la reproduction de la souris.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>in situ Hybridization:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC DIG wash + block buffer set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1585762</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Premix 20x SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1666681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K 20mg/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM2546</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI</td>
<td>D43060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F9037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran Sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI</td>
<td>D20020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM Purple </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11442074001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Dig-AP Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11093274910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A enzyme 10mg/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>EN0531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI</td>
<td>7003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon Sperm DNA 10mg/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15632-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stericup Filter Unit 0.22&mu;m; 500ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Discs 0.2&mu;m; 25mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>6780-2502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline PH 7.4 packets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-5368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunohistochemistry:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G9023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>9460</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histology:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc. </td>
<td>08792-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propylene oxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>110205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gluteraldehyde Solution 50%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPX Mountant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>44581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MidSci</td>
<td>55D1114</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-715-125D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo</td>
<td>400110Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set to 60&deg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-690-625D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dye tracing:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Geuder</td>
<td>G-19775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E.M.S</td>
<td>72680-F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MTTI</td>
<td>FS-100(1,2,6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-5368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>M205 FA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set to 36&deg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-690-506DQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>LSM 510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Surgipath</td>
<td>00240</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Surgipath</td>
<td>00106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Glycerol</td>
<td>G22025-0.5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (4% and 0.4%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>T353-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining lipophilic dye, in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology

Au-delà de la fonction du gène simple de couper profondément dans les réseaux de régulation génétique nécessite de multiples mutations combinées dans un seul animal. Une telle analyse de deux ou plusieurs gènes doit être complétée par hybridation in situ d&#39;autres gènes, ou immunohistochimie de leurs protéines, en tout monté organes en développement ou des sections pour la résolution détaillée des altérations de l&#39;expression cellulaire et tissulaire. Combinant des altérations de gènes multiples nécessite l&#39;utilisation de la CRE ou au conditionnel flipase supprimer les gènes et d&#39;éviter la létalité embryonnaire. Les schémas de sélection requis améliorer considérablement les efforts et le coût proportionnel au nombre de gènes mutés, avec un résultat de très peu d&#39;animaux avec le répertoire complet des modifications génétiques souhaitées. Amortir la vaste quantité d&#39;efforts et de temps pour obtenir ces quelques spécimens précieux, qui sont porteuses de mutations multiples nécessite l&#39;optimisation des tissus. Par ailleurs, une enquête sur un seul animal avec des techniques multiples, il est plus facile de mettre en corrélation des défauts délétion du gène avec des profils d&#39;expression. Nous avons développé une technique pour obtenir une analyse plus approfondie d&#39;un animal donné, avec la capacité d&#39;analyser plusieurs structures histologiquement identifiable ainsi que l&#39;expression des gènes et des protéines tout à partir du même échantillon dans les deux organes tout monté et sections. Bien que les souris ont été utilisés pour démontrer l&#39;efficacité de cette technique, il peut être appliqué à un large éventail d&#39;animaux. Pour ce faire, nous combinons lipophiles colorant de traçage, monter toute l&#39;hybridation in situ, immunohistochimie et l&#39;histologie pour extraire la quantité maximale possible de données.

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Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Une combinaison de différentes techniques pour optimiser la collecte des données à partir de tissus de la souris est présentée.

Combinant colorant lipophile, In situ</emHybridation>, immunohistochimie et l&#39;histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

25.8K vues.  University of Iowa. Une combinaison de différentes techniques pour optimiser la collecte des données à partir de tissus de la souris est présentée.

Combinant colorant lipophile, In situ, immunohistochimie et l'histologie