共焦点画像は、イメージングのためのアイオワカーバーセンターの大学で得られた。資金は、BFにNIDCD（5R01DC00559007）によって提供されていたこのプロジェクトのためのマウスを飼育するためのBF追加サポートするSBIR助成金（MH079805）によって提供されていました

<ol>
	<li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes.">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li><li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing.">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li><li>Bartheld, C. S. v. o. n., Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+tracing+with+DiI:+decalcification,+cryosectioning,+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li><li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection.">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li><li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice.">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li><li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea.">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li></ol>

マウスの組織は、アイオワ州動物実験の大学が定めるガイドラインと規則に従って収集され、委員会（ACURF 0804066）を使用していた。

このビデオでは、我々は与えられた動物（図3）内のデータを相関させることにより、データの収集と結束力を最大限にするために4つの技法を組み合わせる方法を示しています。このアプローチは、このように共局在し、変異の相関効果に関する情報を改善しながら、パブリッシュデータを取得するために必要な時間を繁殖量を減らすこととなります。マウス胎児はこのビデオ、成体マウスだけでなく、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュのような他の動物に利用されたが、同様にこれらの技法を用いて分析することができます。他の種を使用する場合はプロテイナーゼK消化を変更する必要があります。ここでは、特に関心の三神経集団にまでラベルを付けるために、異なる蛍光NeuroVueの染料を使用してください。これらの染料の利点は、単に免疫組織化学に依存する場合に問題となる可能性がある、それらが変異マウスで使用できることであるまたは解析の対象となる変異の影響を受け、そして彼らが逆行し、順行性に5ニューロンをラベルにすることができない場合がありますこと。最近の研究はまた、6 2に同時に標識することができるニューロン集団の数を増加している。後、興味の同じ組織を追跡する親油性染料は、遺伝子転写の解析のために、in situハイブリダイゼーションに使用して分析することができますし、その後タンパク質の分布の免疫組織化学を用いて分析することができます。後者の分析は、表現型の特性6に追加できる詳細な組織学で補完することができます。この多因子解析では、そうでない場合は、より広範なプロトコルとマウスの繁殖の必要性にありえないか、少なくとも可能性がある、同じ動物内で相関分析を通じて新たな洞察を得る可能性を秘めています。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>in situ Hybridization:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC DIG wash + block buffer set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1585762</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Premix 20x SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1666681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K 20mg/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM2546</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI</td>
<td>D43060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F9037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran Sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI</td>
<td>D20020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM Purple </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11442074001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Dig-AP Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11093274910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A enzyme 10mg/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>EN0531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RPI</td>
<td>7003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon Sperm DNA 10mg/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15632-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stericup Filter Unit 0.22&mu;m; 500ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Discs 0.2&mu;m; 25mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>6780-2502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline PH 7.4 packets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-5368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunohistochemistry:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G9023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>9460</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histology:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc. </td>
<td>08792-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propylene oxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>110205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gluteraldehyde Solution 50%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPX Mountant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>44581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MidSci</td>
<td>55D1114</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-715-125D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo</td>
<td>400110Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set to 60&deg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-690-625D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dye tracing:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Geuder</td>
<td>G-19775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E.M.S</td>
<td>72680-F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MTTI</td>
<td>FS-100(1,2,6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-5368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>M205 FA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set to 36&deg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-690-506DQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>LSM 510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Surgipath</td>
<td>00240</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Surgipath</td>
<td>00106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Glycerol</td>
<td>G22025-0.5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (4% and 0.4%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>T353-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining lipophilic dye, in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology

遺伝子調節ネットワークに深くカットする単一の遺伝子の機能を越えて、単一の動物に結合された複数の変異が必要です。 2つ以上の遺伝子のような分析は、細胞および組織発現の変化の詳細な解決のための全体のマウントされている発展途上の臓器またはセクションの両方で、他の遺伝子、またはそれらのタンパク質の免疫組織のin situハイブリダイゼーションで補完する必要があります。複数の遺伝子変異を組み合わせることで、条件付きで遺伝子を削除し、胎生致死を回避するために、CREまたはflipaseを使用する必要があります。必要な繁殖方式は、劇的に努力を強化し、所望の遺伝子改変の全レパートリーを持つ、非常に少数の動物の結果と、変異遺伝子の数に比例するコスト。複数の変異を運んでいるこれらのいくつかの貴重な標本を得るための労力と時間の膨大な量を償却する組織の最適化が必要となる。また、複数のテクニックを持つ単一の動物を調査することで、より簡単発現プロファイルと遺伝子欠失の欠陥を相関させることができます。我々は、与えられた動物のより徹底的な分析を得るために技術を開発している、すべての全体のマウント臓器やセクションの両方で同一の試料から複数の異なる組織学的に認識可能な構造だけでなく、遺伝子と蛋白質発現を分析する能力を。マウスは、この手法の有効性を実証するために利用されているが、それは動物の広い配列に適用することができます。これを行うには、トレース、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織全体のマウントは、データの最大可能量を抽出するために親油性色素を組み合わせる。

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Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

マウス組織からのデータ収集を最大にするために異なる技術の組み合わせが提示される。

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

25.8K ビュー.  University of Iowa. マウス組織からのデータ収集を最大にするために異なる技術の組み合わせが提示される。