Je tiens à remercier les nombreux étudiants de premier cycle qui ont travaillé dans mon laboratoire et a contribué à l&#39;évolution de ces protocoles. NAT a reçu le soutien du Réseau Skidmore-Union, un projet mis en place avec une avance NSF PAYÉ subvention.

I. ARN Mont entier Hybridation in situ dans les élasmobranches marins 1. Fixation de l&#39;embryon et de préparation <ol><li> Patinage embryons peuvent être organisés selon Ballard 7. Étapes optimales pour la détection de l&#39;expression du gène dépend du tissu d&#39;intérêt. Pour suivre l&#39;expression des gènes dans le tractus digestif de skate, les étapes 27-30 sont optimales 7. </li><li> Disséquer embryons dans du PBS, la séparation des embryons à partir du sac vitellin. </li><li> Fixer dans 30 ml de paraformaldéhyde à 4% fraîchement préparé (PFA) dans un tube conique de 50 ml à 4 ° C avec doux balancement. Fixer pendant 24 heures. </li><li> Laver les embryons en PBT, deux fois pendant 15 min, en tournant à la température ambiante. Toutes les recettes de solution pour l&#39;ensemble de montage ARN in situ &#39;s sont inclus (tableau 1). </li><li> Déshydrater embryons par lavage dans une série de méthanol de 25%, 50% et 75% de méthanol: PBT basculement à température ambiante. La durée des lavages dépend du stade de l&#39;embryon. Pour le pré-neurulation mise en scène embryons, 5 min de chaque lavage de la série méthanol est suffisante. Pour les embryons âgés de plus l&#39;étape 30, les lavages peuvent durer jusqu&#39;à 30 minutes. Pour déterminer si les embryons sont suffisamment pénétré et acclimatés à chaque lavage, tenir le tube en position verticale dans votre main. Si les embryons se déposent au fond du tube, alors vous êtes prêt pour le lavage suivant. Si les embryons flottent à la surface de la solution, la solution de changer et répéter ce que l&#39;étape de déshydratation particulier. </li><li> Laver deux fois dans le méthanol à 100% pendant 10 min à bascule doucement. </li><li> Une fois déshydraté à 100% de méthanol, les embryons doivent être conservés à -20 ° C pendant au moins 24 heures avant de procéder avec le protocole. Les embryons ont été correctement stockée à -20 ° C et utilisée pour les montages d&#39;ARN entiers jusqu&#39;à 1 an. </li></ol> 2. Synthèse de l&#39;ARN de la sonde <ol><li> Générer un fragment linéaire du gène dont l&#39;expression que vous voulez détecter. Cela peut être fait soit par amplification par PCR ou linéariser un plasmide avec votre gèned&#39;intérêt. Pour amplifier par PCR, pour choisir un des sites de liaison d&#39;amorces dont flanquent le gène insérer et retenir un des sites de liaison d&#39;ARN polymérase de la région amplifiée. Pour les plasmides couramment utilisés tels que PBS ou pGEM, M15 amorces sens et antisens sont idéales. Alternativement, linéariser un plasmide par digestion de 15 pi de QIAGEN miniprep ADN avec une enzyme qui clive à l&#39;extrémité 5 &#39;du gène. Gel extraire et purifier l&#39;aide du kit QIAquick approprié. </li><li> La transcription inverse de l&#39;ARN en utilisant la sonde 8 ul de plasmide ou 100 ng de produit PCR linéaire comme un modèle en utilisant l&#39;ARN polymerase appropriée (voir le tableau 2 pour la réaction de transcription). </li><li> Incuber réaction de transcription inverse pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Pour confirmer la réaction, exécutez 1 pl de la réaction de transcription sur un agarose à 1% / TAE gel. Exécuter un gel à 100 mVolts jusqu&#39;à ce que le colorant vient de lancer dans le gel. Une seule bande de premier plan doit être visible. Le fragment d&#39;ADN linéaire modèle peut être à peine visible à un plus haut moléculaireslar poids. </li><li> Ajouter 1 ul de RNase-Free DNase I de la réaction de transcription et incuber à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Pour précipité, ajouter 100 pi de TE pH 8, 10 pi 4 M LiCl, 300 ul EtOH à 100% et incuber à 20 ° C pendant au moins 60 minutes ou toute la nuit. </li><li> Spin pendant 10 min dans une microcentrifugeuse 4 ° C à 14000 rpm. </li><li> Laver culot avec 70% EtOH et de l&#39;air sec. </li><li> Resuspendre sonde d&#39;ARN dans 20 pi de dH 2 O. Ajouter 80 ul de tampon d&#39;hybridation (tampon d&#39;hybridation doit être pré-chauffé à 70 ° C). La sonde peut être stockée dans un tampon d&#39;hybridation de 80% pendant plusieurs mois à -20 ° C ou plus à -80 ° C. </li></ol> 3. Embryon pré-traitement et hybridation <ol><li> Retirer embryons conservés dans le méthanol à 100% à partir de -20 ° C. Pour les plus jeunes embryons passez à l&#39;étape (3,2). Pour plus tard, mis en scène embryons (stade 29/30 &lt;) vous pouvez voir une couche de l&#39;épiderme qui a «levé» hors du corps de l&#39;embryon. Sous le microscope, dissect large de la couche épidermique de maximiser la pénétration de la sonde. </li><li> Placer les embryons propres flacons à scintillation en verre. Réhydrater les embryons dans la série méthanol inverse décrit ci-dessus: (75%, 50%, 25% de méthanol: PBT) en basculant doucement chaque solution pour chaque 5-30 minutes à température ambiante. Réhydratation complète avec deux lavages de 10 min pour le PBT, doucement chaque bascule. </li><li> Pour supprimer tous les pigments, les embryons de blanchiment avec du peroxyde d&#39;hydrogène à 6% en PBT pendant 1 heure à température ambiante, se balançant. </li><li> Retirer le peroxyde d&#39;hydrogène en lavant trois fois en PBT, (bascule à la température ambiante, 10 minutes chacun). </li><li> Traiter embryons avec la protéinase K pour permettre la pénétration de la sonde lors de l&#39;hybridation. Le montant de la protéinase K et la durée du traitement dépend du tissu que vous voulez examiner et l&#39;âge de l&#39;embryon. Tissus plus superficiels et les plus jeunes embryons nécessitent K plus courts et moins protéinase, tandis que les tissus plus profonds et plus d&#39;embryons exigent une plus grande concentration et un traitement plus long time pleinement perméabiliser l&#39;embryon pour l&#39;hybridation de la sonde. Par exemple, pour détecter Shh dans l&#39;endoderme intestinal des embryons au stade de skate 29, 30 ug / ml de protéinase K / PBT est incubé pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Rincez rapidement les embryons in PBT pour laver la protéinase K. </li><li> Pour désactiver la protéinase K, les embryons postfix avec 4% de PFA, le glutaraldéhyde 0,2% en PBT pendant 20 min, balançant doucement. </li><li> Laver deux fois pendant 10 minutes avec du PBT. </li><li><ol class="lalpha"><li> Pour pré-hybridation, ajouter 2-3 ml de solution d&#39;hybridation préchauffé à des embryons, juste assez pour les couvrir. Balancer doucement dans un bain d&#39;eau chauffée à 70 ° C pendant 1 heure. </li><li> Pour préparer la solution d&#39;hybridation, préchauffer sonde d&#39;ARN à 70 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir sur glace. Diluer 15-20 ul de sonde d&#39;ARN à 2 ml de solution d&#39;hybridation frais préchauffé, pour obtenir une concentration finale de 0,5-1,0 g / ml. Retirer pré-Hybe et ajouter dilué sonde d&#39;ARN pour les embryons. Embryons doivent être juste couvert par solution, unjj solution d&#39;hybridation plus si nécessaire. Couvercle bien sûr du flacon à scintillation. Hybrider en basculant doucement dans un bain d&#39;eau chauffée à 70 ° C pendant une nuit. </li></ol></li></ol> 4. Message d&#39;hybridation et d&#39;hybridation Lavage Anticorps <ol><li> Retirez solution d&#39;hybridation avec la sonde à partir d&#39;embryons et les placer dans un flacon à scintillation frais ou tube Eppendorf. La sonde peut être conservé à -20 ° C et réutilisé dans l&#39;avenir. Pour la post-hybridation lavages, les embryons placer dans un Netwell assis dans une plaque à 6 puits de culture de tissu. </li><li> Laver 3 fois pendant 30 minutes dans chacune des préchauffé Solution n ° 1, à bascule à 70 ° C. </li><li> Laver 3 fois pendant 30 minutes dans chacune des préchauffé Solution n ° 2, bascule à 70 ° C. </li><li> Laver 3 fois pendant 5 minutes chacun dans du TBST, bascule à la température ambiante. </li><li> Pré-bloc avec du sérum de mouton 10% inactivé par la chaleur dans du TBST pendant 1 heure, se balançant à la température ambiante. </li><li> Transfert d&#39;embryons de Netwell dans un flacon à scintillation en verre frais. Ajouter anti-DIGFragments Fab (1:5000) dans le sérum de mouton 1% inactivé à la chaleur / TBST aux embryons. Basculez nuit à 4 ° C. </li></ol> 5. Hybridation Anticorps Message Lave <ol><li> Retirez et jetez les anticorps. Embryons replacer dans Netwell pour lavages. </li><li> Laver 3 fois pendant 5 minutes dans chacune des TBST, se balançant à la température ambiante </li><li> Laver au moins 6 fois pendant 1 heure chacun, se balançant à la température ambiante. </li><li> Laver la nuit dans TBST, se balançant à 4 ° C. Comme les lavages d&#39;anticorps post-aider à réduire le bruit de fond, en maximisant le nombre et la durée des lavages est préférable. Les embryons sont régulièrement lavés dans du TBST à 4 ° C, le week-end. </li></ol> 6. Détection de la sonde <ol><li> Maquillage solution NTMT frais et stériliser par filtration. </li><li> Jeter la solution de lavage TBST et d&#39;embryons place dans un flacon à scintillation en verre propre. Laver 3 fois en embryons NTMT frais pendant 10 min chacune à la température ambiante, à bascule. </li><li> Retirer NTMT laver et ajouter le mélange de réactionde 1 x NBT / BCIP 1 x en NTMT. Comme ces réactifs sont sensibles à la lumière, couvrir flacon à scintillation dans du papier et du rock à la température ambiante. </li><li> Surveiller la réaction de couleur toutes les 15 min jusqu&#39;à ce que l&#39;expression du gène désiré est clairement visible. Sondes forts peuvent prendre aussi peu que 10 minutes pour se développer. Sondes faibles peuvent prendre 1-2 heures. Ne laissez pas passer réaction trop longtemps ou coloration de fond commencent à apparaître (l&#39;embryon entier commence à tourner une couleur terne pourpre ou brun). </li><li> Laver 2 fois pendant 10 minutes dans chacune des évaluations PBT à la température ambiante, à bascule. </li><li> Postfix embryons dans du paraformaldéhyde à 4%, glutaraldéhyde à 0,1% pendant 1 heure à température ambiante. Les embryons peuvent être indéfiniment magasin dans un fixateur à 4 ° C. </li><li> Visualisez embryons avec un stéréomicroscope à dissection. Pour produire un fond bleu clair pour les photos, les embryons placer dans un plat avec pré-durci agarose à 1% / PBS. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs pour I. ARN Mont entier hybridation in situ chez les élasmobranches marins ARN monture toute expression in situ de l &#39;dépeignant de Sonic hedgehog (Shh) et HOXA13 dans des embryons de skate sont présentés dans la figure 1. L&#39;expression de Shh chez les vertébrés supérieurs se trouve dans l&#39;endoderme notochorde et le tube digestif, ce mode d&#39;expression est conservée dans le patin (Figure 1a) 8,9. Élasmobranches marins ont une méthode unique d&#39;osmorégulation qui utilise la glande rectale de sels sécrètent. HOXA13 expression est élevé dans la glande rectale développement (figure 1b) 10. HOXA13 rôle dans la structuration produit du gène de la glande rectale demeure inconnue. II. Paraffine inclusion et la coupe des tissus élasmobranches 1. Récolte et préparation des tissus <ol><li> Disséquer les tissus désiré et fixer formol à 10% pendant 24-48 h, se balançant à la température ambiante. Paraformaldéhyde 4% (PFA) peut également être utilisé comme fixateur(Voir Discussion). </li><li> Laver fixateur par un lavage dans du PBS, 3 fois pendant 30 min chacun. En fonction de la taille du tissu, le temps de lavage peut être réduit à 10 minutes, ou plus de 1 h. </li><li> Déshydrater embryons par lavage dans une série d&#39;éthanol de 25%, 50% et 75% d&#39;éthanol: PBS à bascule à la température ambiante. Encore une fois, le temps pour chaque lavage dépendra de la taille du tissu. Pour 0,5 cm 3 tissus, incuber chaque lavage pendant 15 min. Augmenter le temps pour les grandes pièces. Si le stockage à long terme des tissus est souhaitée, lavez deux autres fois dans l&#39;éthanol à 75% et stocker à -20 ° C pendant un maximum d&#39;un an. Sinon, passez à l&#39;étape suivante. </li><li> En outre déshydrater en lavant 3 fois dans de l&#39;éthanol à 100% pendant 15 min chacun, se balançant. </li></ol> 2. Paraffine inclusion et la coupe <ol><li> Clarifier les tissus par lavage 2 fois dans du xylène pendant 5 min dans chacune des fioles à scintillation en verre à couvercle à bouchon à vis. Xylène rendra le tissu fragile, il ne faut pas dépasser un total de 10 min pour ahes. Le tissu translucide devrait ressembler quand vous le tenez devant une lumière. Si le tissu est encore très opaque après deux lavages, faire un lavage supplémentaire dans le xylène pendant 5 minutes et ensuite avec le protocole. Ne manipulez xylène à l&#39;intérieur d&#39;une hotte avec des gants. </li><li> Retirer le xylène et remplir le flacon à scintillation aux 2/3 avec de la paraffine fondue. Incuber dans une étuve à 60 ° C pendant 30 min. Lors de la remise de paraffine dans le flacon, vous remarquerez la paraffine solidifier le long des parois de la fiole. Placer le flacon dans le four et laissez la paraffine pour re-dissoudre pendant quelques minutes. Prendre le flacon hors du four et faire tourbillonner la solution d&#39;un mini à mélanger et à remplacer dans le four pour le reste de l&#39;incubation. </li><li> Répétez la paraffine incubations deux fois plus pendant 30 min. </li><li> Incuber dans de la paraffine à deux reprises pendant une heure chaque. Changer la paraffine une dernière fois et laisser incuber pendant la nuit dans le four à 60 ° C. </li><li> Le lendemain, placer le tissu dans une chambre de bain de paraffine chauffée et mise sous vide pendant 2-3 h. Cela facilitera l&#39;infiltration de paraffine dans les tissus et éliminer les bulles d&#39;air. Pour certains types de tissu mince, une étape de vide peut ne pas être nécessaire, mais il est nécessaire pour les embryons entiers ou le tube digestif et d&#39;autres organes avec des compartiments luminales. </li><li> Après sous vide facilitée infiltration de tissu endroit du tissu, dans un moule métallique avec de la paraffine fondue, et laisser refroidir sur une plaque de glace. Laisser sur la glace ou à 4 ° C pendant la nuit avant d&#39;essayer de retirer le tissu du moule. Les blocs de paraffine de tissu peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° C. </li><li> Bloc de paraffine lieu sur un microtome et coupez 8 sections um. Les articles doivent être flottait sur un bain-marie chauffé à 48 ° C et montées sur des lames de verre SuperFrost Plus *. </li><li> Lames sèches pendant la nuit dans un four à 37 ° C. </li><li> Sections conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> III. Alcian Blue / Red nucléaire rapide Stain of Tissue élasmobranches 1. Alcian Blue Stain pour mucines <ol><li> Lieu glisse aux articles tournés vers le haut sur une glissière chaud. Faire fondre pendant 45 min. </li><li> Lieu glisse dans un support. Toutes les solutions qui en découlent sont contenus dans des cuves à l&#39;intérieur d&#39;une hotte. Les lames sont lavées en les transférant d&#39;une baignoire avec une solution à l&#39;autre. Assurez-vous que les niveaux de solution dans les cuves couvre les diapositives, les tissus sur les lames soient complètement submergés. Dissoudre la paraffine en lavant diapositives 2 fois dans du xylène pendant 5 min chacun. </li><li> Laver les lames deux fois avec de l&#39;éthanol à 100% pendant 1 min à chaque fois. </li><li> Réhydrater les lames dans une série d&#39;éthanol (75%, 50%, éthanol à 25%) dans chaque solution de lavage pendant 1 min. Laver à l&#39;dH 2 O pendant 1 min. </li><li> Colorer dans une solution de Bleu Alcian, pH 2,5 pendant 15 min. </li><li> Développer tache par un lavage à l&#39;eau courante pendant 3 min. Plongez une fois dans dH 2 O. </li><li> Contre nucléaire en solution de contraste Fast Red pendant 10 min. </li><li> Laver à l&#39;eau courante pendant 3 min et plongez dans dH 2 O en même temps. </li><li> Dehydéshydrater dans une série d&#39;éthanol (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) pendant 20 immersions chacun, soit 1 min chacune. Laver 2 fois dans du xylène pendant 5 min chacun. Monter avec support de montage DPX et des lamelles. Laisser le milieu de montage à sécher et durcir pendant 48 heures sous la hotte avant de manipuler les diapositives. </li></ol>

<ol>
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W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch,+Leucoraja+erinacea.">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li><li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium:+a+review.">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li><li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett's+esophagus:+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort.">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li><li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status.">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li><li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. 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Je n&#39;ai rien à déclarer.

Les protocoles présentés sont des méthodes classiques de suivi de l&#39;expression des gènes et d&#39;identifier les types de cellules différenciées, et ont été adaptés pour une utilisation chez les élasmobranches marins. D&#39;autres modifications de ces protocoles peut être nécessaire pour s&#39;adapter à différentes espèces d&#39;élasmobranches. La plus grande préoccupation concernant l&#39;ensemble de montage ARN in situ de l &#39;est le risque de contamination ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Élasmobranches marins sont évalués modèles animaux pour des études biomédicales et de la génomique car ils sont les vertébrés les plus primitifs pour avoir l&#39;immunité adaptative et des mécanismes uniques pour l&#39;osmorégulation 1-3. Comme les plus primitives de vie des vertébrés à mâchoire-avec des appendices paires, les élasmobranches sont un modèle évolutif important, en particulier pour les études de l&#39;évolution et de développement. Élasmobranches marins ont également été utilisés pour étudier la toxicologie aquatique et la physiologie du stress en relation avec le changement climatique 4. Ainsi, le développement et l&#39;adaptation des méthodes est nécessaire pour faciliter et étendre l&#39;utilisation de ces vertébrés primitifs à de multiples disciplines biologiques. Ici, je présente l&#39;adaptation réussie de l&#39;ARN monture toute hybridation in situ et des techniques histologiques pour étudier l&#39;expression des gènes et histologie chez les élasmobranches. Suivi de l&#39;expression des gènes est un outil caractéristique de biologie développementalegues, et il est largement utilisé pour étudier les processus de développement 5. ARN monture toute hybridation in situ permet la visualisation et la localisation des transcrits de gènes spécifiques dans les tissus de l&#39;embryon en développement. Le modèle d&#39;expression d&#39;un message d&#39;un gène peut donner un aperçu de ce que les processus de développement et les décisions du destin cellulaire un gène peut contrôler. En comparant le profil d&#39;expression d&#39;un gène à différents stades de développement, le gain de connaissance sur la façon dont le rôle d&#39;un gène changements au cours du développement. Alors que l&#39;ensemble de montage in situ de l &#39;offre un moyen de localiser l&#39;expression du gène des tissus, des techniques histologiques permettent l&#39;identification des types de cellules différenciées et des tissus. Colorations histologiques ont des fonctions variées. Taches générales sont utilisées pour mettre en évidence la morphologie des cellules, par exemple l&#39;hématoxyline et à l&#39;éosine pour la coloration générale de noyaux et le cytoplasme, respectivement. D&#39;autres taches peuvent mettre en évidence cellule spécifiquetypes. Par exemple, le bleu alcian tache rapportée dans cet article est une tache largement utilisé pour identifier mucosaccharides cationique. La coloration du tube digestif avec le bleu alcian peut identifier la répartition des cellules caliciformes qui produisent mucosaccharides. Les variations de constituants mucosaccharide sur les peptides courts distinguer les cellules caliciformes par fonction au sein de l&#39;appareil digestif 6. À l&#39;aide de l&#39;ARN de montage ensemble des méthodes in situ d &#39;histochimique et en même temps, les décisions destin cellulaire peut être relié à l&#39;expression spécifique du gène. Bien que l&#39;ARN in situ de l &#39;histochimie et sont largement utilisés par les chercheurs, leur adaptation et leur utilisation chez les élasmobranches marins ont rencontré un succès limité et varié. Ici, je présente protocoles élaborés pour les élasmobranches et utilisé sur une base régulière dans mon laboratoire. Même si une nouvelle modification de l&#39;ARN dans la méthode d&#39;hybridation in situ &#39;s peut être nécessaire pour s&#39;adapter aux différentes espèces, les protocoles décrits ici pournir un bon point de départ pour les chercheurs désireux d&#39;adapter l&#39;utilisation des élasmobranches marins à leurs recherches scientifiques.

Exemples de coloration au bleu alcian dans différentes régions du L. erinacea tube digestif sont présentés dans la figure 2. Mucine acide contenant des cellules globlet sont bien visibles par le bleu alcian tache à travers le tube digestif. La répartition des mucines acides diffère dans les différentes régions du tube digestif, ce qui reflète les différences de fonction. Mucines acides sont faiblement produite dans l&#39;intestin en spirale et le cloaque, tandis qu&#39;une concentrat...

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RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

En combinant les méthodes de montage ARN ensemble<em&gt; In situ</emHybridation&gt; et l&#39;histologie, l&#39;expression des gènes peuvent être liés aux décisions du destin cellulaire dans l&#39;embryon en développement. Ces méthodes ont été adaptées aux élasmobranches marins et faciliter l&#39;utilisation de ces animaux comme des organismes modèles pour les études biomédicales, la toxicologie et comparative.

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

rna-situ-hybridization-whole-mount-embryos-cell-histology-adapted-for

Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K vues.  Union College. En combinant les méthodes de montage ARN ensemble In situ et l'histologie, l'expression des gènes peuvent être liés aux décisions du destin cellulaire dans l'embryon en développement. Ces méthodes ont été adaptées aux élasmobranches marins et faciliter l'utilisation de ces animaux comme des organismes modèles pour les études biomédicales, la toxicologie et comparative.

Vidéo: RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Recherche

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Utilisation Mont entier<em&gt; In situ</emHybridation&gt; Lien vers biologie moléculaire et Organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...