Ce travail a été soutenu par un financement à DJJ à travers le projet DFG # JA2108 / 2-1.

REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent notre méthode pour mener une expérience in situ sur les stades embryonnaires et larvaires de L. stagnalis. Lorsqu&#39;une étape implique l&#39;utilisation d&#39;un produit chimique dangereux ceci est indiqué par le mot «ATTENTION» et toutes les procédures de sécurité appropriées devraient être adoptées. Liens vers les fiches signalétiques représentatifs des produits chimiques dangereux sont fournis dans le dossier supplémentaire 1. Recettes pour tous les réactifs sont fournis dans le dossier complémentaire 2. Assemblée 1. de Decapsulation Appareil <ol><li> Pour ce faire, connectez un 20 ml seringue jetable à un tube de silicium (avec un diamètre interne de 1 mm et un diamètre extérieur de 3 mm) à l&#39; aide d&#39; une pointe de P1,000 coupé à une longueur appropriée comme indiqué sur la Figure 2A. </li><li> Collez une lame de microscope standard pour un plat inversé Petri grande. Tape le tube de silicium immédiatement adjacente à la lame de microscope , comme illustré sur la figure60; 2C et 2D. </li><li> Reposez une aiguille de verre tiré sur la lame de microscope et doucement l&#39; insérer dans le tube de silicium jusqu&#39;à ce que la pointe de l&#39;aiguille dépasse environ 20% de la largeur du diamètre intérieur du tube (voir la figure 2C et 2D). Une fois que l&#39;aiguille est en position du ruban adhésif vers le bas pour la boîte de Pétri. </li><li> Laisser l&#39;extrémité libre du tube de silicium pour se reposer dans une autre boîte de Pétri qui permettra de recueillir le matériau décapsulé. </li></ol> 2. Echantillon Collection, Fixation et Decapsulation Remarque: Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. <ol><li> Recueillir soigneusement les chaînes d&#39;œufs provenant des parois d&#39;un aquarium. Pour ce faire, utilisez un morceau plat de plastique souple comme une spatule pour gratter la chaîne d&#39;œufs hors du substrat, et d&#39;utiliser une passoire à thé en plastique pour pêcher la chaîne d&#39;oeuf flottant sur l&#39;eau. Scène et trier le matériau au microscope en utilisant le guide fourni dans la Figure1. </li><li> Placez la chaîne d&#39;oeuf sur une serviette en papier et de faire une incision longitudinale le long de la masse d&#39;oeufs à l&#39;aide des pinces de poids plume. Rouler les capsules d&#39;oeufs sur la chaîne d&#39;oeuf et enlever le plus de la matière gelée que possible de chaque capsule en les poussant autour de la serviette en papier à l&#39;aide des pinces de poids plume. </li><li> Utilisation de la pince de plume, transférer les capsules d&#39;oeufs dans une boîte de Pétri contenant 5 ml d&#39;eau du robinet. Continuer à recueillir des capsules de-gélifiée œufs des stades de développement souhaités dans ce plat. Recueillir suffisamment de capsules de tous les stades de développement pour l&#39;expérience de WMISH planifiée puis passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Lorsque l&#39;on travaille avec des larves plus développées (5 jours après la première division (DPFC) et plus) anesthésier les avant la fixation. NOTE: Cela permettra d&#39; éviter de contracter les muscles qui rend l&#39;interprétation des motifs de coloration in situ très difficiles. <ol><li> Relax larves (alors qu&#39;ils sont encore dans leur capsules) dans une solution à 2% p / v de MgCl 2 • 6H 2 O pendant 30 min avant la fixation. </li><li> Évaluer le degré de détente après 30 min en submergeant plusieurs larves tout en restant dans leurs capsules d&#39;œufs en solution fixateur et le suivi de leur réponse sous un microscope. Incomplètement larves détendue se rétracte dans leurs coquilles, tandis que les larves complètement détendu ne répondra pas. Une fois que ces larves ont été assouplies passer à l&#39;étape suivante. </li></ol></li><li> Transférer les capsules d&#39;oeufs à l&#39; aide d&#39; une pipette large alésage en matière plastique pouvant être scellé dans un tube qui fournit 10 fois le volume des capsules d&#39;oeufs (par ex., 1 ml de capsules réglées nécessiterait un tube ml 10+). </li><li> Aspirer autant de liquide que possible du tube et de le remplacer par un volume de solution de fixation qui est 10 fois le volume des capsules d&#39;oeufs réglées. Tournez doucement les capsules d&#39;oeufs en fixateur à température ambiante pendant le temps approprié pour chaque stade de développement (voir la figure 1). </li><li> Discontinrotation ue et laisser les capsules de couler et aspirer la solution de fixateur dans un conteneur à déchets approprié. </li><li> Laver les capsules d&#39;oeufs en remplaçant la solution fixative avec une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de Tween-20 (PBTw) et tournant à température ambiante pendant 5 min. Aspirer le PBTw et répéter deux fois. </li><li> Retirer les embryons et les larves de leurs capsules en utilisant l&#39;appareil (voir la section 1 pour plus de détails) montre la figure 2. Dessinez les capsules dans la seringue de 20 ml, fixez le tube puis dissiper les capsules à travers le tube et le passé de l&#39;aiguille de verre dehors dans le plat de collection. REMARQUE: Normalement, la majorité (&gt; 90%) de toutes les capsules devrait avoir besoin un seul passage à travers le dispositif. Dans de nombreux cas, la membrane de la capsule est endommagée, mais les embryons et les larves restent à l&#39;intérieur de la capsule rompue. Retraiter ce matériau par simple tirant dans la seringue et de dissiper à nouveau. </li><li> Recueillir les embryons décapsulé et les larves dans un tube de 1,5 ml en utilisant un microropipette (un P20 0 - 3 jours larves, et P200 pour les larves plus âgées avec l&#39;extrémité de la pointe coupée). NOTE: Une pause (jusqu&#39;à plusieurs mois) dans le protocole peut être faite à ce stade. Si cela est nécessaire, le matériau decapsuled doit être recueilli dans un tube de 1,5 ml pour le stockage (passez à l&#39;étape suivante). Sinon continuer immédiatement protocole n ° 3. </li><li> Autoriser les embryons et les larves tombent au fond du tube et aspirer le surnageant. Remplacer avec 33% d&#39;éthanol (EtOH) en PBTw et laisser reposer pendant 5 - 10 min. Répéter l&#39;opération avec 66% EtOH dans PBTw et 100% EtOH. Laver les larves deux fois dans 100% EtOH à température ambiante. Conserver le matériau à -20 ° C dans 100% EtOH. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à continuer, réhydrater les échantillons en supprimant l&#39;EtOH à 100% et le remplacement de 66% EtOH dans PBTw, laissez reposer pendant 5 à 10 min. Répéter l&#39;opération avec 33% EtOH dans PBTw, laisser reposer pendant 5 - 10 min. Enfin laver avec 3x 5 min lavages de PBTw pour assurer que tout EtOH est éliminé. </li></ol> 3. protéinase-K, TEA et Post-fixation NOTE: Nous trouver d&#39;effectuer les étapes suivantes dans des petits paniers avec un plancher de maille la méthode la plus efficace et doux pour échanger rapidement des solutions critiques de temps. Bien que ceux - ci peuvent être faits maison, nous utilisons des paniers (de taille moyenne) qui sont compatibles avec la manipulation du liquide robot de Intavis InSituPro -Vsi (de www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Ces paniers peuvent être rapidement et facilement déplacés entre les puits d&#39;une boîte de 12 culture tissulaire (TCD) pour des solutions d&#39;échange, ou de la solution peuvent être aspirés à partir du puits à l&#39;aide d&#39;une pipette. Sinon, tous les échanges de solutions peuvent être réalisées sans ces paniers en aspirant simplement le surnageant des larves. Dans ce cas, un mouvement tourbillonnant douce se concentrera tous les embryons et les larves au centre du plat permettant le surnageant à retirer à partir du bord du puits. Ce qui suit suppose que l&#39;utilisateur emploie des paniers pour les échanges de solutions. <ol><li> En utilisant une pipette, Les embryons de transfert et les larves dans un panier assis dans un TCD 12 puits avec 2 ml de PBTw. NOTE:. Le nombre d&#39;embryons et / ou des larves qui peuvent être ajoutés dépend du stade de développement à l&#39;étude, mais une règle générale est de maintenir au moins 25% de l&#39;espace libre au sol d&#39;embryons / de larves (ie, ne pas surchargez le panier). </li><li> Préparer un puits adjacent avec 2 ml de la solution protéinase-K approprié (voir Figure 1), et un autre 2 puits avec 2 ml de 0,2% Glycine chacun. Déplacez chaque panier dans le puits contenant la concentration appropriée de protéinase-K et commencer immédiatement la synchronisation. </li><li> Après 10 min déplacer chaque panier dans un puits contenant 0,2% de glycine et on incube pendant 5 min. Puis déplacez chaque panier dans le second puits avec 0,2% Glycine et incuber pendant 5 min. Laver le Glycine avec 3x 5 échanges min de 3 ml PBTw. </li><li> Retirer la solution PBTw et traiter les échantillons une fois avec fraîchement préparé Triéthanolamine (TEA) solution pendant 5 min ATTENTION! Ne pas agiter. Remplacer avec 3 ml de solution de TEA fraîchement préparé pendant 5 min. Ne pas agiter. Aspirer la majeure partie de la solution de thé à partir des échantillons. Ajoutez le Triéthanolamine fraîchement préparé avec de l&#39;anhydride acétique (TEAAA) solution et incuber pendant 5 min. ATTENTION! Ne pas agiter. </li><li> EN OPTION - Alors que l&#39;étape ci-dessus est en phase d&#39;incubation, préparer un autre nouveau lot de solution de TEAAA et répétez l&#39;étape ci-dessus. NOTE: Ce second traitement avec TEAAA est facultative, mais peut aider à éliminer complètement tous les arrière-plan avec des sondes sujettes à générer fond. </li><li> Retirer la solution de TEAAA par aspiration à partir du puits et le remplacer par 3 ml de PBTw. Ne pas agiter. Retirez le PBTw et appliquer 3 ml de 3,7% de formaldéhyde dans PBTw. Remuer doucement de temps en temps au cours d&#39;une incubation de 30 min. </li><li> Retirer le fixateur en aspirant à partir du puits et le remplacer par 3 ml de PBTw. Transférer le matériau dans un tube de 1,5 ml. REPlacez l&#39;PBTw avec un tampon d&#39;hybridation et incuber pendant 5 min à température ambiante - ATTENTION. </li><li> Placer les tubes dans un bloc chaud à la température ambiante, et régler la température à la température d&#39;hybridation souhaitée. NOTE: La température d&#39;hybridation est sonde spécifique et devra être empiriquement optimisé, cependant, nous trouvons 55 ° C pour être une bonne température initialement procès. Laisser le bloc à venir à la température d&#39;hybridation, et laisser les échantillons de pré-hybrident pendant environ 15 min (soit le temps qu&#39;il faut pour préparer les ribosondes, plus est pas nécessaire). Préparer des volumes adéquats (normalement 100 pi) des ribosondes dilué. Nous concentrations de sonde généralement essai de 100 et 500 ng / ml comme une gamme initiale. Nous préparons ribosondes selon 12. </li><li> Retirer le tampon d&#39;hybridation à partir des échantillons et ajouter la sonde dans un tampon d&#39;hybridation pour les échantillons. Superposition avec 100 ul (ou un volume suffisant pour former une phase au-dessus de la Buffe d&#39;hybridationr) de l&#39;huile minérale. REMARQUE: L&#39;huile minérale empêche une vaste condensation qui formera au cours de l&#39;étape d&#39;hybridation longue. la condensation étendue modifie de manière significative à la fois la chimie de la solution d&#39;hybridation et la concentration de la sonde. </li><li> Dénature la sonde et l&#39;ARN cible en chauffant les échantillons à 75 ° C pendant 10 min, puis réduire la chaleur à la température d&#39;hybridation souhaitée. Laisser l&#39;hybridation se dérouler pendant un minimum de 12 heures (O / N) ou plus (24-48 h). </li><li> Pendant l&#39;hybridation supprimer un seul tube à partir du bloc thermique, faire pivoter rapidement entre le pouce et l&#39;index de suspendre les larves sans perturber la phase huileuse, et de le remplacer dans le bloc thermique. Répétez cette fois tous les 6-12 heures ou plus. </li></ol> 4. Washes Hot et immunodétection NOTE: Bien que nous utilisons un robot de manipulation de liquide pour les étapes suivantes, ceux-ci peuvent facilement être effectuées manuellement. Dans ce cas, les embryons et les larves shoULD être conservés dans les tubes de 1,5 ml ont été hybridées. Tous les échanges de solutions ultérieures sont aspirés et a ajouté avec une pipette P1,000. Quand elle est réalisée manuellement chacune des étapes suivantes devrait employer 1 ml de chaque solution. <ol><li> La chaleur des volumes adéquats (3 ml chacune, pour chaque échantillon) de la 4x, 2x et 1x solutions de lavage à la température d&#39;hybridation. </li><li> Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage 4x pendant 15 minutes chacun à la température d&#39;hybridation. Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage 2x pendant 15 min chacun à la température d&#39;hybridation. Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage pendant 15 min 1x chacun à la température d&#39;hybridation. </li><li> Laver tous les échantillons une fois avec 1 x tampon de chlorure de sodium Citrate de sodium + 0,1% de Tween (SSC + 0,1% Tween) à la température d&#39;hybridation. Laisser les échantillons refroidir à la température ambiante. </li><li> Laver tous les échantillons deux fois dans 1x SSC + 0,1% de Tween pendant 15 min Remplacer cette solution SSC 1x avec le tampon acide maléique (MAB) et laisser reposer pendant 10 min Répétez le MAB wcendre. Remplacer MAB avec une solution de bloc et incuber pendant 1,5 heure. </li><li> Échanger la solution de bloc pour une solution d&#39;anticorps (1: 10000 dilution de l&#39;anticorps dans une solution de blocage) et on incube pendant 12 heures (O / N) à température ambiante sous agitation douce. </li></ol> 5. Développement de couleur et de montage <ol><li> Aspirer la solution d&#39;anticorps et laver 15 fois avec PBTw pendant 10 minutes chacun. Remplacez PBTw avec 1x tampon phosphatase alcaline (AP) et incuber pendant 10 min. </li><li> Bien que le produit de l&#39; étape d&#39;incubation ci - dessus, préparer la solution de coloration AP (voir fichier complémentaire 2) - ATTENTION. Transférer le matériel dans un TCD bien et remplacer la solution 1x AP avec une solution AP de coloration. Notez le temps de sorte que la durée de la réaction colorée a lieu pour peut être enregistré. Surveiller le développement du modèle de marquage jusqu&#39;à ce que le rapport signal d&#39;arrière-plan est optimale. </li><li> Pour arrêter le développement de la couleur, enlever la solution de coloration 1x AP (en disposer dans le wast appropriée conteneur), et appliquer 2 ml de PBTw et notez le temps maintenant. Rincer deux fois avec PBTw pendant 5 minutes chacun. Utilisez l&#39;une de ces rinçages pour transférer le matériau dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Retirez le PBTw et appliquer 1 ml de formaldehyde à 3,7% en PBTw et agiter ou faire pivoter pour moins de 30 min à température ambiante (cela peut aussi être fait O / N). </li><li> Laver le fixateur avec 3 lavages de PBT (éliminer le fixateur des déchets dans un conteneur à déchets approprié). Laver les échantillons 3 fois à 50 ° C dans de l&#39;eau déminéralisée. NOTE: Ces lavages éliminent la précipitation des sels qui peuvent devenir visibles lors de la compensation et les étapes de visualisation. </li><li> Décider si les échantillons doivent être montés dans benzyl benzoate: Alcool benzylique (BB: BA, également connu sous le nom de Murray clair) ou de glycérol. NOTE: Nous préférons l&#39;agent de compensation plus puissant BB: BA en L. embryons stagnalis sont quelque peu opaque. Les échantillons destinés à être montés en BB: BA devra d&#39;abord être déshydraté par une série d&#39;éthanol. Les échantillons destinés à être montés dans 60%le glycérol peut être monté immédiatement. </li><li> Transférer les échantillons dans la solution de montage (BB: BA ou 60% de glycérol) à l&#39;aide d&#39;une pipette. NOTE: Lors du montage en BB: BA cela doit être fait dans un verre bien (BB: BA va fondre le plastique polycarbonate). </li><li> Laisser les échantillons pour effacer pendant 5 - 10 min, puis les monter sur une lame en utilisant un nombre approprié de lamelles empilées comme espaceurs (1 lamelle pour les échantillons &lt;1 DPFC, 2 Lamelles pour les échantillons&gt; 1 DPFC). NOTE: montures entières peuvent maintenant être visualisés à l&#39;aide d&#39;un microscope composé avec optique DIC. </li></ol>

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J., W&#246;rheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions.">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).</li><li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development.">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li><li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

La méthode décrite ici permet la visualisation efficace des transcrits d&#39;ARN avec vraisemblablement des niveaux variables d&#39;expression au sein de tous les stades de développement de Lymnaea stagnalis. Pour supprimer des embryons et des larves de leurs capsules , nous trialed une variété de traitements chimiques et physiques, un choc osmotique et rapporté pour d&#39; autres encapsulated- le développement des organismes modèles. Cependant, dans nos mains la méthode que nous décrivons ici est la ...

Les mollusques sont un groupe d&#39;animaux qui détiennent l&#39;intérêt d&#39;une grande diversité de disciplines scientifiques. En dépit de leur diversité morphologique 1, la richesse en espèces ( en second lieu seulement aux arthropodes en termes de nombre d&#39;espèces 2) et de la pertinence d&#39;une large gamme de 3 commerciaux, médicaux et scientifiques 4 questions 5-8, il y a relativement peu d&#39; espèces de mollusques qui peuvent prétendre à être à la fois des modèles scientifiques bien équipés et faciles à entretenir dans un environnement de laboratoire. Un mollusque qui est beaucoup utilisé par des disciplines telles que la neurobiologie 9, écotoxicologie 10 et plus récemment la biologie évolutionniste 11,12, est Lymnaea stagnalis, principalement en raison de sa large distribution et de l&#39; extrême facilité d&#39;entretien. En dépit de sa popularité en tant que «modèle» organisme et sa longue histoire d&#39;utilisation par les biologistes du développement 13-19, la portée et la puissance des outils moléculaires disponibles pour le L. StAGNalis communauté scientifique est loin derrière celle des modèles plus traditionnels animaux (drosophile, souris, oursin de mer, nématodes). Notre volonté de développer Lymnaea comme un modèle moléculaire découle d&#39;un intérêt pour les mécanismes moléculaires qui guident la formation de la coquille. Cela nous a motivé pour affiner un ensemble de techniques qui permettraient de la visualisation efficace, cohérente et sensible de l&#39; expression des gènes au cours du développement de l &#39;Lymnaea. Whole mount hybridation in situ (WMISH) est largement utilisé pour une variété d&#39;organismes modèles et a été utilisé pendant plus de 40 ans 20. Dans ses différentes formes, ISH peut être utilisée pour localiser spatialement locus spécifiques sur des chromosomes, un ARNr, un ARNm et des micro-ARN. L&#39; un des défis que nous avons besoin pour faire face avant d&#39; affiner une méthode de WMISH pour L. stagnalis était la question des embryons doucement et efficacement l&#39; extraction et les larves de différents stades de til capsules d&#39;oeufs dans lesquels ils sont déposés. Cette extraction ou «désencapsulation», doit être réalisée de manière efficace afin de collecter un matériel adéquat pour une donnée expérience in situ, tout en conservant l&#39; intégrité morphologique et cellulaire. Alors que d&#39; autres organismes modèles subissent également le développement encapsulées dans nos mains , aucune des méthodes rapportées pour ces espèces peut être employée avec succès dans L. stagnalis. Les objectifs généraux de cette méthode sont donc: pour extraire L. stagnalis embryons et des larves de leurs capsules dans un mode à haut débit, d&#39;appliquer des traitements de pré-hybridation qui optimisent le signal de WMISH, pour préparer des embryons et des larves avec WMISHsignals satisfaisantes pour l&#39; imagerie.

<table><tbody><tr><td>Featherweight forceps</td><td>Ehlert &amp;amp; Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Glasger&amp;auml;tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 well tissue culture dishes</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Nuclease freeBovine Serum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Deionised formamide</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Standard formamide</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blocking powder</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodium citrate dihydrate (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Mineral oil&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&amp;nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

Whole mount hybridation in situ (WMISH) est une technique qui permet la résolution spatiale des molécules d&#39;acide nucléique (souvent ARNm) dans une préparation de tissu «tout support», ou le stade de développement (comme un embryon ou larve) d&#39;intérêt. WMISH est extrêmement puissant car il peut contribuer de manière significative à la caractérisation fonctionnelle des génomes de métazoaires complexes, un défi qui devient de plus d&#39;un goulot d&#39;étranglement avec le déluge de données de séquence de la prochaine génération. En dépit de la simplicité conceptuelle de la technique de temps est souvent nécessaire d&#39;optimiser les différents paramètres inhérents aux expériences WMISH pour les nouveaux systèmes de modèles; de subtiles différences dans les propriétés cellulaires et biochimiques entre les types de tissus et des stades de développement signifient qu&#39;une méthode de WMISH unique peut ne pas convenir à toutes les situations. Nous avons mis au point un ensemble de méthodes WMISH pour les ré-émergentes modèle gastéropode Lymnaea stagnalis qui génèrent cohérente etsignaux WMISH clairs pour une gamme de gènes, et dans tous les stades de développement. Ces méthodes comprennent l&#39;affectation des larves de l&#39; âge chronologique inconnue à une fenêtre ontogénétique, l&#39;élimination efficace des embryons et des larves de leurs capsules d&#39;oeufs, l&#39;application d&#39;un traitement à la protéinase-K approprié pour chaque fenêtre ontogénétique, et l&#39; hybridation, post-hybridation et immunodétection des pas. Ces méthodes fournissent une base à partir de laquelle le signal résultant d&#39;une transcription d&#39;ARN donné peut être encore affiné avec des ajustements spécifiques de la sonde (principalement sonder la concentration et la température d&#39;hybridation).

Les motifs de coloration de WMISH représentatifs représentés sur la figure 3 ont été produites en utilisant la technique décrite ci - dessus, correspondent à une variété de schémas d&#39;expression spatiale pour les gènes impliqués dans une variété de processus moléculaires allant de la formation de la coquille (gène Novel 1, 2, 3 et 4), à la signalisation cellule-cellule (Dpp) à la régulation de la transcription (Brachyu...

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A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.8K vues.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

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A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Une méthode non invasive pour<em&gt; In situ</em&gt; Détermination du succès de l&#39;accouplement chez les femelles homards américains (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Recherche

Environnement

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualisation du microbiote dans Guts Tick par hybridation entier-Montez In Situ

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Génétique

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ</emHybridation> (LNA flux FISH): une méthode d&#39;bactérienne détection de l&#39;ARN petits

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Immunologie et infection

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Biologie du développement

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biologie

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Un débit élevé In situ</emMéthode d&#39;hybridation> pour caractériser les modes d&#39;expression d&#39;ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effet de la Femme accessoire Gland produits sur la ponte dans les gastéropodes

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

A Mont entier

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Une méthode non invasive pour

Visualisation du microbiote dans Guts Tick par hybridation entier-Montez In Situ

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ (LNA flux FISH): une méthode d'bactérienne détection de l'ARN petits

Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons

Whole mont In Situ de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Un débit élevé In situ pour caractériser les modes d'expression d'ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital

ARN

Effet de la Femme accessoire Gland produits sur la ponte dans les gastéropodes

Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus