Ce travail a été soutenu par des subventions à l&#39;ED de la James S. McDonnell 21 Programme er Prix siècle, et le Prix du directeur des NIH Innovateur Nouvelle. AGE a été soutenu en partie par une bourse postdoctorale du California Institute of Regenerative Medicine.

1. Analyse de contrôle de la qualité de l&#39;échantillon d&#39;ARN avec 2100 bioanalyseur Avant de commencer, <ol><li> Dénaturer l&#39;échelle et vos échantillons à 70 ° C pendant 10 min. Réfrigérer immédiatement sur la glace. </li><li> Nettoyer les électrodes avec des instruments RNaseZAP pendant 1 min, suivie par l&#39;eau sans RNase pendant 10 sec. Autoriser les électrodes sécher à l&#39;air. </li><li> Préparer la matrice de gel par pipetage 550 pl de la matrice de gel dans un filtre rotatif fourni avec le kit. Centrifuger à 1500 RCF pendant 10 min à température ambiante. Aliquoter filtré sur gel en 65 aliquotes et stocker à 4 ° C pour un maximum de 1 mois. </li><li> Afin de préparer la station d&#39;amorçage à puce, <ol class="lalpha"><li> Insérer une seringue de 1 ml dans le clip et dans l&#39;adaptateur luer lock. </li><li> Ajustez la plaque de base à la position C en desserrant la vis sous la base, en soulevant la plaque et en resserrant la vis. </li><li> Ajustez le clip de la seringue pour la première position. </li></ol></li><li> Equilibrer le concentré de teinture à la température ambiante. Vortex pendant 10 sec. Ajouter 1 l de teinture à une aliquote de 65 pl de gel filtré. Vortex bien et centrifuger à 13 000 RCF pendant 10 min à température ambiante. Utiliser moins d&#39;un jour. Lorsque vous êtes prêt à exécuter vos échantillons, </li><li> Position d&#39;une puce sur la station d&#39;amorçage. Dans ce protocole, nous utilisons des puces ARN 6000 nano. Pour charger le gel, <ol class="lalpha"><li> Pipette 9 ul du mélange gel-dye dans le bien marqués avec un blanc &quot;G&quot; sur un fond noir. Assurez-vous que votre astuce est positionné au bas du puits. </li><li> Positionner le piston de la seringue à 1 ml. Fermer la station d&#39;amorçage. Assurez-vous qu&#39;il cliquez-écluses. </li><li> Appuyez sur le piston vers le bas, lentement mais sûrement jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit tenue par le clip. </li><li> Attendre 30 sec. Libérez le clip. </li><li> Laissez le piston monte en soi. Après qu&#39;il cesse de bouger, d&#39;attendre quelques secondes et tirez sur le piston à la position de 1 ml. Ouvrez la station d&#39;amorçage. </li></ol></li><li> Pipette 9 ul du mélange gel-dye dans chacun des 2 puits marqué &quot;G&quot;. </li><li> Pipeter 5 pl du marqueur dans chacun des 12 puits d&#39;échantillon et de l&#39;échelle bien. </li><li> Pipeter 1 pl de l&#39;échelle préparés échelle bien. </li><li> Pipeter 1 ul de chaque échantillon dans le puits d&#39;échantillon. </li><li> Pipeter 1 pl de la marque dans chaque échantillon inutilisée bien. </li><li> Vortex de la puce pendant 1 min à 2400 rpm. </li><li> Pour exécuter la puce, <ol class="lalpha"><li> Démarrez le logiciel 2100 Expert. </li><li> Position de la puce et fermer le couvercle. Si l&#39;instrument est en ligne, une icône apparaîtra si le couvercle est ouvert ou fermé et quel type de puce est insérée. Assurez-vous que le port correct est sélectionné. </li><li> Dosage Exécutez sein d&#39;embarquement 5 mn les échantillons pour prévenir évaporation. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;amplification et l&#39;étiquetage Pour se préparer à l&#39;analyse des microréseaux, des échantillons d&#39;ARN sont amplifiés et marqués, habituellement dans une réaction basée sur l&#39;ARN polymérase T7 3. ADNc double brin est généré par transcription inverse. L&#39;ADNc est utilisé dans une réaction de transcription in vitro pour générer ce qui est connu comme ARNc. Cette réaction est effectuée en présence de ribonucléotides étiquetés, produisant des quantités de microgramme d&#39;ARN marqués d&#39;hybridation tableau. Le choix de l&#39;amplification / étiquetage des méthodes dépend de la plateforme microarray postérieurement à être utilisé. Dans cette section, nous décrivons la génération d&#39;ARN marqué par fluorescence à l&#39;aide d&#39;Agilent kit rapide étiquetage Amp. <ol><li> Pipeter 50 ng à 5 ug d&#39;ARN dans un tube de 1,5 ml. Le volume ne doit pas dépasser 8,3 pi. Si nécessaire, concentrer votre échantillon d&#39;ARN par centrifugation sous vide ou par précipitation avec de l&#39;alcool. </li><li> Ajouter 1,2 ul d&#39;apprêt T7. </li><li> Porter à un volume final de 11,5 ul avec l&#39;eau sans RNase. </li><li> Incuber à 65 ° C pendant 10 min pour dénaturer l&#39;ARN. Nous vous recommandons d&#39;utiliser un thermocycleur avec un couvercle chaud pour éviter la condensation dans le haut du tube. </li><li> Pendant les 10 minutes d&#39;incubation, Buffer 5X First Strand chaude à 80 ° C pendant 5 min. Vortex et spin bas. Gardez à température ambiante jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> Après l&#39;incubation de 10 min, refroidir rapidement les échantillons d&#39;ARN dénaturé sur la glace. </li><li> Préparer le mélange maître d&#39;ADNc. Par réaction, ajoutez la ligne suivante: <ol class="lalpha"><li> 4 pl de tampon 5X First Strand </li><li> 2 pl 0,1 M TNT </li><li> 1 pl 10 mM de dNTPs </li><li> 1 pl MMLV-RT enzymatiques </li><li> 0,5 sur ul RNase. </li></ol></li><li> Mélanger les composants en inversant le tube 4 fois. Ne pas vortex. Isoler pour recueillir le contenu au fond du tube. </li><li> Ajouter 8,5 ul de mélange maître par échantillon. Mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 40 ° C, suivi de 10 min à 65 ° C. Nous vous recommandons d&#39;utiliser un thermocycleur avec un couvercle chauffé. </li><li> Transférer les tubes à la glace pendant 5 min. </li><li> Préparer le mélange maître de transcription. Par réaction, ajoutez la ligne suivante: <ol class="lalpha"><li> 15,3 ul eau sans nucléase </li><li> 20 plTampon de transcription 4X </li><li> 6 pl 0,1 M TNT </li><li> 8 PNT ul </li><li> 6,4 ul de PEG 50% (PEG doit être préchauffée à 40 ° C et un vortex pour assurer la remise en suspension) </li><li> 0,5 ul RNase Out </li><li> 0,6 ul pyrophosphatase inorganique </li><li> 0,8 ul T7 RNA polymérase </li><li> 2,4 ul-Cy3 ou Cy5 CTP </li></ol></li><li> Centrifuger brièvement les échantillons pour recueillir le contenu au fond du tube. </li><li> Ajouter 60 ul de Mix Master transcription par échantillon. </li><li> Incuber à 40 ° C pendant 2 heures. </li><li> Ajouter 20 ul d&#39;eau sans RNase. </li><li> Purifier l&#39;ARNc marqué pour enlever nucléotides non incorporés. Nous recommandons l&#39;utilisation de Qiagen RNeasy mini colonnes. </li><li> Quantifier les ARNc marqué. Nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop2000 en mode de mesure biopuces. Assurez-vous que vous sélectionnez l&#39;ARN-40 comme le type d&#39;échantillon. </li><li> Concentration de l&#39;échantillon record, le rendement (calculé comme la concentration, multipliée par le volume) et l&#39;activité spécifique (calculée comme 1000, multiplié par la ration de concentration du colorant sur la concentration ARNc). Pour l&#39;hybridation puces, il est nécessaire d&#39;atteindre un rendement d&#39;au moins 825 ng et une activité spécifique d&#39;au moins 8 pmol / mg. </li></ol> 3. L&#39;hybridation Microarray <ol><li> Tournez sur la station d&#39;hybridation et réglé à 65 ° C au moins 2 heures avant l&#39;hybridation commence. </li><li> Pour préparer l&#39;échantillon hybridation, mélanger les suivants dans un tube de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3 ARNc (ce qui est généralement votre &quot;traité&quot; de l&#39;échantillon) </li><li> 825 ng Cy5-ARNc (ce qui est généralement votre «référence» de l&#39;échantillon) </li><li> 11 ul d&#39;agent de blocage 10X. </li><li> Ajouter l&#39;eau sans RNase à un volume final de 52,8 ul </li><li> Ajouter 2,2 ul de tampon de fragmentation. </li></ol></li><li> Vortex à basse vitesse pour mélanger. </li><li> Incuber à 60 ° C pendant exactement 30 minutes. Cette étape est la fragmentation des ARNc, qui génère des fragments marqués d&#39;hybridation tableau. Il est très important pour incuber exactement comme décrit. Nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;un thermocycleur avec un couvercle chauffé. Il est très important pour incuber exactement comme décrit pour générer des sondes de la durée moyenne correcte. Une fragmentation excessive ou insuffisante se traduira par de faux négatifs ou faux positifs. </li><li> Ajouter 55 ul de tampon d&#39;hybridation 2X pour arrêter la fragmentation. Mélanger à la pipette, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. </li><li> Centrifuger 1 min à vitesse maximale pour recueillir le contenu au fond du tube. Si des bulles sont observées, centrifugeuse plus de temps à les supprimer. </li><li> Placer le tube sur la glace, protégé de la lumière. Chargez l&#39;échantillon sur le tableau dès que possible. </li><li> Pour charger le tableau, d&#39;abord préparer la chambre d&#39;hybridation. Ce protocole décrit l&#39;utilisation de tableaux 4x44K Agilent avec le système d&#39;hybridation et de la Roche-Nimblegen chambres mélangeur A4. <ol class="lalpha"><li> Placez une diapositive dans la puce le code à barres de montage / démontage d&#39;outils, d&#39;abord. </li><li> Ouvrir un mélangeur A4 et exposer l&#39;adhésif. Tenir le tableau et l&#39;assemblage / désassemblage outil pour empêcher tout mouvement, placer le mélangeur A4 sur la diapositive, en commençant à l&#39;extrémité. Assurez-vous qu&#39;il est correctement aligné sur l&#39;outil. Bâton mélangeur tout au long de la glissière de tableau. </li><li> Tirez sur la fin de la table de mixage pour enlever la lame / montage mélangeur. </li><li> Utilisation de l&#39;outil braiment, la presse tout au long du joint adhésif pour s&#39;assurer qu&#39;il est solidement collé à coulisseau. Petites bulles d&#39;air piégées entre l&#39;adhésif et la lame peut être vu sur un fond sombre. Prenez le temps supplémentaire pour éliminer ces bulles avec l&#39;outil braiement. Votre tableau est maintenant prêt à être chargé. </li></ol></li><li> Utiliser une pipette à déplacement positif à une charge de 100 pl de l&#39;échantillon d&#39;hybridation. Poussez le bout serré dans le trou du port, puis passer lentement et en douceur pour que l&#39;air n&#39;est pas emprisonné dans la zone de tableau. Ne jamais essayer d&#39;aspirer l&#39;échantillon sauvegarder. Une fois l&#39;ensemble de l&#39;échantillon a été distribuée, garder la pointe sur le hublot, sans relâcher le piston. Lorsque l&#39;échantillon couvre la totalité du tableau et le liquide commence à sortir de l&#39;évent, enlever rapidement la pipette. Seul le piston communiqué une fois que la pointe est loin de la glissière. </li><li> Tamponnez délicatement l&#39;excès de liquide dans les deux ports. Assurez vous de ne pas tirer l&#39;échantillon hors de la chambre elle-même. </li><li> Recouvrez les trous du port avec des autocollants en utilisant une pince à épiler. </li><li> Mettez la lame sur la station d&#39;hybridation, et vérifiez que les trous vessie sont correctement positionnés sur les joints toriques. Cela permettra d&#39;assurer un bon mélange lors de l&#39;hybridation. </li><li> Fermez le couvercle coulissant et le couvercle station. Réglez la station de mélange en mode B. </li><li> Hybrider le tableau à 65 ° C pendant 17 heures. </li><li> Préparer le tampon de lavage 2 en ajoutant de Triton X-102 à une concentration finale de 0,005%. Gardez à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 4. Laver Microarray <ol><li> Ajouter Triton X-102 à Wash Buffer 1 à une concentration finale de 0,005%. Conserver à températur ambiantee. </li><li> Lorsque l&#39;hybridation est terminé, remplir un verre plat &quot;A&quot; avec le tampon de lavage 1. Le plat doit être assez grand pour tenir l&#39;outil de montage / démontage et de permettre des manœuvres aussi bien. Tous les lavages doit être fait dans de la verrerie. Eviter les plats en plastique, car ils ont tendance à lessiver les composés résultant de fond élevé dans le tableau. </li><li> Mettez un rack de diapositives et un barreau dans un plat à coloration «B». Remplir avec le tampon de lavage 1, faire en sorte qu&#39;il recouvre la baie. Placer sur une plaque d&#39;agitation à température ambiante. </li><li> Mettez un barreau sur un plat de coloration vide &quot;C&quot; et le placer sur une plaque d&#39;agitation. </li><li> Retirez le tableau et le mettre dans l&#39;outil de montage / démontage. Plonger l&#39;ensemble dans le plat &quot;A&quot;. </li><li> Tout en maintenant l&#39;outil de montage / démontage et la diapositive à partir des côtés opposés d&#39;une seule main, soigneusement décoller le mélangeur A4. Assurez vous de ne pas rayer la zone de tableau. </li><li> Vite placer la lame dans le rack de coloration plat &quot;B&quot;. A partir de maintenant, l&#39;exposition à l&#39;air doit être minimisée car le colorant Cy5 est sensible à l&#39;ozone. Ne lavez pas plus de 8 tableaux à la fois. </li><li> Laver pendant 1 minute en remuant à vitesse moyenne. </li><li> Remplissez coloration plat &quot;C&quot; avec le tampon de lavage préchauffé 2. Placer les lames et laver pendant 1 minute. </li><li> Très lentement, retirez le porte-diapositive de coloration plat &quot;C&quot; pour minimiser les gouttelettes laissées sur la diapositive. </li><li> Sécher le glisser en faisant tourner pendant 2 minutes. Si une centrifugeuse compatibles n&#39;est pas disponible, centrifuger les glisser dans un tube conique de 50 ml ou un coup de gaz argon sur elle. </li><li> Placer les lames dans un tube conique de 50 ml et le remplir avec du gaz argon. Balayage immédiatement pour éviter la perte de signal. Nous recommandons d&#39;utiliser le scanner GenePix 4000B de Molecular Devices. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Bonne qualité totale échantillons d&#39;ARN devrait produire seulement deux pics majeurs lorsqu&#39;il est exécuté dans un bioanalyseur de contrôle de qualité, correspondant aux deux principales espèces d&#39;ARN ribosomal. Certains dégradation de l&#39;ARN se montrer comme un frottis avant le pic premier ARN ribosomal. Fortement dégradées, l&#39;ARN de faible qualité montrera un large pic ou d&#39;une série de pics au temps de rétention faible, tandis que les 2 pics ARN ribosomique seront de très faible intensité ou pas identifiables à tout. Pour des exemples de la sortie 2100 bioanalyseur, voir la figure 1. L&#39;Expert 2100 logiciel calcule un numéro intégrité de l&#39;ARN, ou RIN, comme une mesure quantitative de la qualité de l&#39;ARN. Échantillons de haute qualité, avec des valeurs RIN supérieur à 9, sont évidemment mieux pour les applications de biopuces. Cependant, nous avons utilisé des échantillons avec des valeurs RIN aussi bas que 5,2 pour générer données de biopuces de qualité raisonnable. Tableaux de bonne qualité devrait produire un signal à des valeurs élevées PMT relativement faible. Dans notre expérience, la plupart des transcriptions devraient être présents à des niveaux similaires dans l&#39;échantillon expérimental et de référence; massive, de vastes changements dans l&#39;expression génique sera probablement n&#39;ont aucune signification biologique. Par conséquent, la plupart du tableau devrait ressembler plutôt jaune que verte ou rouge. Signaux de bonne qualité devrait également être dans une plage dynamique tels que les histogrammes signal entièrement chevauchent. Pour des exemples, voir la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Exemple de quatre échantillons d&#39;ARN isolés à partir de tissus de tumeurs cérébrales humaines. L&#39;ARN a été isolé en utilisant le protocole présenté en 3.1.1. La qualité des échantillons a été évaluée en utilisant le bioanalyseur 2100 sur une puce 6000 ARN tel que décrit au paragraphe 3.1.3. Les échantillons sont représentatifs de quatre qualités ARN distincts: A, de très bonne qualité d&#39;ARN (RIN&gt; 9); B, partiellement dégradées ARN (RIN 5-6, noter le pic de nettement plus faible pour l&#39;ARNr 28S); C, fortement dégradées ARN (RIN &lt; 3); D, presque complètement dégradé ARN (RIN = 2). Nous avons utilisé avec succès des échantillons avec des qualités similaires ou supérieures à B (RIN&gt; 5,2) pour les applications de biopuces en aval. Des pointes de flèches solides et ouverts indiquent la position de la 18S et 28S ARNr des espèces, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Exemples d&#39;images de tableau et des diagrammes de dispersion. Un aperçu, faites glisser l&#39;ensemble, montrant les quatre tableaux au format 4X44K Agilent; B, numérisation haute résolution de l&#39;une des zones de tableau, noter que ni des signaux (vert ou rouge) est prédominante; C, diagramme de dispersion de l&#39;image dans B, note que les signaux totalement le chevauchement et pas plus de 1x10 -6 fonctionnalités sont à l&#39;intensité de saturation.

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

Profilage de l&#39;expression avec des puces à ADN offre une approche simple pour identifier les gènes différentiellement exprimés entre deux échantillons biologiques. Le succès des expériences de profilage d&#39;expression de haute qualité nécessitent des échantillons d&#39;ARN, l&#39;étiquetage robuste et d&#39;hybridation. Dans notre expérience, les tableaux et les kits commerciaux d&#39;Agilent étiquetage fournissent des données de haute qualité à un coût raisonnable. Bien Agilent propose également de leurs propres machines et l&#39;hybridation de numérisation, nous privilégions le système d&#39;hybridation de Roche-Nimblegen et le GenePix 4000B biopuces scanner de Molecular Devices. Notez que l&#39;unité d&#39;hybridation Roche-Nimblegen était anciennement connu sous le système d&#39;hybridation Maui. Après la récente acquisition d&#39;entreprise par Roche, les mélangeurs A4 ont été abandonnées. Dès l&#39;instant où j&#39;écris ces lignes, ils peuvent encore être trouvés par d&#39;autres vendeurs tels que Diagnostics Kreatech ( <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> ; ce site propose également un outil pratique éventail de compatibilité), mais la disponibilité du stock à long terme est incertaine. Autres systèmes d&#39;hybridation sont disponibles (par exemple, d&#39;Agilent), mais si mélangeurs compatible peut être trouvé pour le tableau utilisé, nous recommandons le système de la Roche-NimbleGen pour sa qualité et de reproductibilité.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

Profilage de l&#39;expression Microarray du système nerveux fournit une approche puissante pour identifier les activités de gènes dans différents stades de développement, les différents états physiologiques ou pathologiques, la réponse au traitement, et, en général, toute condition qui est testée expérimentalement, 1. Profilage de l&#39;expression des tissus neuronaux nécessite l&#39;isolement de l&#39;ARN de haute qualité, l&#39;amplification de l&#39;ARN isolé et l&#39;hybridation de puces à ADN. Dans cet article, nous décrivons les protocoles des expériences biopuces reproductibles à partir de tissus tumeur au cerveau 2. Nous allons commencer par réaliser une analyse de contrôle de qualité des échantillons d&#39;ARN isolés avec Agilent 2100 Bioanalyzer «lab-on-a-chip&quot; de la technologie. Haute qualité des échantillons d&#39;ARN sont essentiels pour la réussite de toute expérience microarray, et le bioanalyseur 2100 fournit un moyen rapide, mesure quantitative de la qualité de l&#39;échantillon. Les échantillons d&#39;ARN sont ensuite amplifiés et marqués en effectuant la transcription inverse pour obtenir l&#39;ADNc, suivi par transcription in vitro en présence de nucléotides marqués à produire étiquetés ARNc. En utilisant un kit de marquage bicolore, nous marquerons notre échantillon expérimental avec Cy3 et un échantillon de référence avec Cy5. Les deux échantillons seront ensuite combinées et hybridé à des tableaux d&#39;Agilent K 4x44. Double-couleurs des tableaux offrent l&#39;avantage d&#39;une comparaison directe entre deux échantillons d&#39;ARN, augmentant ainsi la précision des mesures, en particulier pour de petits changements dans les niveaux d&#39;expression, parce que les deux échantillons d&#39;ARN sont hybridés de manière compétitive aux puces une seule. Les tableaux seront analysés lors des deux longueurs d&#39;onde correspondant, et le ratio de Cy3 au Cy5 signal pour chaque fonctionnalité sera utilisée comme une mesure directe de l&#39;abondance relative de l&#39;ARNm correspondant. Cette analyse identifie des gènes qui sont différentiellement exprimés en réponse à des conditions expérimentales testées.

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DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Nous démontrons l&#39;utilisation de puces à ADN pour le profilage de l&#39;expression du système nerveux. Nous décrivons le contrôle qualité de l&#39;ARN, l&#39;étiquetage de l&#39;échantillon, et l&#39;hybridation de tableau et de numérisation.

Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.8K vues.  University of California, Davis. Nous démontrons l'utilisation de puces à ADN pour le profilage de l'expression du système nerveux. Nous décrivons le contrôle qualité de l'ARN, l'étiquetage de l'échantillon, et l'hybridation de tableau et de numérisation.

Vidéo: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Démonstration technique de l&#39;hybridation tableau Whole Genome génomique comparative

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Recherche

Biologie

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrication et utilisation de puces à micro-environnement (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profilage Glycan des polymères végétaux de la paroi cellulaire en utilisant Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

À faire et à ne pas faire de cryo-microscopie électronique: Notions sur la préparation de l&#39;échantillon et de collecte de données de haute qualité pour la reconstruction 3D macromoléculaire

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthèse de la longueur d&#39;onde de décalage d&#39;ADN à l&#39;aide de sondes d&#39;hybridation cyanine photostable

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

L&#39;étude de la protéine système de contrôle de la qualité des<em&gt; D. discoideum</em&gt; Utilisation de cellules vivantes d&#39;imagerie à température contrôlée

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...