Nous tenons à remercier L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. et D. Hayhurst Kuch d&#39;assistance dans le domaine. K. Galbreath aimablement fourni des échantillons de foie pika de la vallée de Bella Coola. Merci à A. Gonçalves da Silva et K. Larsen pour des discussions intéressantes qui ont contribué à la conception de cette méthode d&#39;échantillonnage génétique non invasif. Ce travail a été financé par les sciences naturelles et en génie du Canada, Discovery, et UBC Okanagan subventions de recherche individuelles sur MAR. Un Fonds national suisse de bourses de doctorat soutenue PBSKP3_128523 PH. Cette étude a été réalisée suivant le protocole de soins aux animaux de l&#39;Université de la Colombie-Britannique (Numéro de certificat: A07-0126).

1. Snare cheveux Avant de mettre en place un piège, un emplacement idéal doit être déterminée dans l&#39;habitat ou des talus d&#39;éboulis pika. Cela inclut des tas de foin, qui sont des caches végétation qui recueillent les animaux en fin d&#39;été ainsi que des excréments frais trouvés sur les sites des latrines. Des bandes de ruban adhésif d&#39;emballage (10-50cm de longueur) sont enroulées pour fournir une surface de 360 ​​° collants et sont disposées de façon toile d&#39;araignée à l&#39;enveloppe de l&#39;entrée de tas de foin le pika (fig. 1) ou le site des latrines. Selon la configuration de la roche, un morceau de fil de pêche peuvent être utilisés pour soutenir la structure de la caisse claire de cheveux, mais ce n&#39;est souvent pas nécessaire lorsque les entrées sont assez petites (&lt;30 cm de diamètre), une description complète de l&#39;utilisation de la ligne de pêche peuvent être trouvés dans Henry et Russello (2010) 3. Cheveux pièges sont vérifiés aussi souvent que possible, et des échantillons de cheveux déposé sur la bande (Fig. 2) sont ensuite recueillies et étiquetées. Une fois transporté au laboratoire, les poils sont retirés de la bande collante en utilisant une pince stérile et transféré dans des tubes cryogéniques et conservés à -20 ° C jusqu&#39;à ce que davantage de manipulation. Les échantillons de cheveux regroupés le long d&#39;un filet de cheveux sont considérés comme appartenant à un seul individu, tandis que les échantillons groupés de façon indépendante sont supposés appartenir à des individus différents. Dans ce dernier cas, les cheveux sont ensuite placés dans des tubes différents. Ces hypothèses peuvent ensuite être testées au moyen d&#39;empreintes ADN et des calculs de probabilité d&#39;identité basée sur des microsatellites données génotypiques. 2. Extraction de l&#39;ADN Depuis les cheveux Pika est très mince et contient une ampoule minuscule racine, nous avons montré précédemment que d&#39;un minimum de 25 poils sont nécessaires pour obtenir des quantités suffisantes d&#39;ADN pour l&#39;amplification par PCR de bonne qualité aval 3. Nous avons utilisé l&#39;ADN du système IQ (Promega, Madison, WI, USA) et une version légèrement modifiée des instructions du fabricant pour l&#39;isolement de l&#39;ADN provenant d&#39;échantillons de cheveux. Premièrement, l&#39;échantillon de cheveux est centrifugé dans une centrifugeuse micro-afin d&#39;éviter la perte des cheveux, tout en ouvrant le tube. Puis la solution d&#39;incubation est préparé en mélangeant 80 pi de solution d&#39;incubation avec 10 ul de la TNT (1M) et 10 pi de la protéinase K (18ng/ml) pour aboutir à une concentration finale de 0,1 M TNT et 1.8ng/ml de protéinase K. incubation solution (100 pi) est ajouté à l&#39;échantillon et incubés à 56 ° C pendant 1 heure. En attendant, la solution de lyse est préparée en ajoutant 1 pl de la TNT (1M) pour chaque 100 ul de tampon de lyse, résultant en une concentration finale de 0,01 M de DTT. Préparé solution de lyse (200 pi) est ensuite ajouté à l&#39;échantillon, avec 7 pl d&#39;ADN QI de résine, vortexés pendant 3 secondes à grande vitesse et incubée à température ambiante pendant 5 minutes. L&#39;échantillon est ensuite vortexé pendant 2 secondes et insérées dans le support magnétique, où la séparation des billes magnétiques de la solution de produit. La solution restante est ensuite aspiré et mis au rebut, en faisant attention à ne pas perturber le culot de résine magnétique. L&#39;échantillon est ensuite traitée avec 100 pi de la solution de lyse préparé, vortex et remis sur le stand magnétique où la séparation se produit à nouveau. Le tampon de lyse est aspirée et mis au rebut, et cette étape est répétée trois fois en utilisant un tampon de lavage (100 pi). L&#39;échantillon est ensuite mis à sécher dans le support magnétique pendant 15 minutes. Une fois sec, 100 pi de tampon d&#39;élution est ajouté à l&#39;échantillon et incubés à 65 ° C pendant 5 minutes. L&#39;échantillon est vortexé et inséré dans le support magnétique. La solution contenant maintenant l&#39;ADN élue est alors transféré dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et stockés à -20 ° C jusqu&#39;à ce que de nouvelles manipulations. L&#39;ADN d&#39;échantillons de foie a également été extraites en utilisant le système IQ ADN et utilisé comme contrôle positif pour des amplifications PCR. 3. L&#39;amplification par PCR L&#39;ADN obtenu à partir de notre filet de cheveux non invasive et des échantillons de foie ont ensuite été utilisées pour amplifier un ensemble de communément utilisé des marqueurs moléculaires (microsatellites, AFLP, mitochondrial du cytochrome b et le marqueur de sexage ZFX / ZFY). PCR ont été effectuées en utilisant une Veriti thermocycleur (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dans un volume de 25 ul contenant: 10 - 20 ng d&#39;ADN, 0,5 uM de chaque amorce, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP, 10 μ de sérum albumine bovine (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) et 0,5 U AmpliTaq ADN polymérase Gold (Applied Biosystems). Paramètres de cyclisme pour les loci microsatellites ont été optimisés en utilisant un programme de cyclisme touchdown (10 min à 95 ° C, 35 cycles à 95 ° C pendant 30 s, 30 s recuit, et 45 s à 72 ° C, suivie d&#39;une étape finale à 72 ° C pendant 10 min.) La température de recuit a diminué de 1 ° C par cycle de 60 à 55 ° C jusqu&#39;à atteindre le sixième cycle, à quel point les 29 cycles restants ont continué à 55 ° C. Cyclisme paramètres pour les fragments mitochondrial ont été décrits ci-dessus, mais se composait de 35 cycles, avec un recuittempérature de 50 ° C. Amplified fragment length polymorphism a été entrepris suivant le protocole pour les génomes de vertébrés décrites par Bonin 4. Enfin, le sexage moléculaire a été entreprise en utilisant la PCR-RFLP du ZFX / ZFY loci à la digestion des enzymes de restriction Hinfl 5. Les produits de PCR de la microsatellites, AFLP et le cytochrome séquences B ont été effectuées sur un analyseur ABI 3130XL génétique (Applied Biosystems), tandis que digérée ZFX / ZFX fragments ont été longent une échelle de 100 pb (New England Biolabs) sur un gel d&#39;agarose 3% contenant 2,5% de gel de l&#39;ADN SYBR Safe. tache (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et visualisés en utilisant un système Red personnels imagerie gel (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) Microsatellites et AFLP ont été visualisées en utilisant GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) et le chromatogramme ADN mitochondrial a été visualisée en utilisant Sequencher v4.7 (Gene Code des sociétés, Ann Harbour, MI, USA). 4. Les résultats représentatifs L&#39;ADN extrait d&#39;échantillons de poils obtenus en utilisant notre piège non invasif ont été utilisés pour amplifier par PCR différents types de marqueurs moléculaires. Comme base de comparaison, en utilisant l&#39;ADN extrait des échantillons de foie a été amplifié aux côtés de nos échantillons de cheveux. Nucléaire loci microsatellites ont été amplifié avec succès à la fois pour les cheveux et échantillons de foie (Fig. 3). Bien que l&#39;intensité du signal était plus grande lors de l&#39;utilisation des échantillons de foie, cela n&#39;a pas eu un effet négatif sur la notation génotype (Fig. 3). Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant les AFLP (fig. 4), les séquences d&#39;ADN mitochondrial (fig. 5), et le marqueur ZFX / ZFY sexage moléculaire (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Un exemple d&#39;un piège de cheveux non invasif mis en place à un tas de foin. Des bandes de ruban adhésif d&#39;emballage enroulé claires sont disposées d&#39;une façon toile d&#39;araignée pour enfermer l&#39;entrée de la pile de foin. Un morceau de fil de pêche est utilisé ici pour offrir un soutien supplémentaire pour la caisse claire cheveux. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Un piège cheveux réussie contenant un grand nombre de cheveux collée au ruban d&#39;emballage. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Un chromatogramme représentant microsatellites nucléaires (Ocp6) 8 tel qu&#39;il apparaît dans GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l&#39;ADN des tissus du foie, et il est hétérozygote (354/358) à ce locus. Le chromatogramme du bas représente un autre individu présentant un génotype hétérozygote (358/362) basées sur l&#39;ADN extrait de poils. Alors que le signal du chromatogramme de l&#39;échantillon de cheveux a une intensité plus faible que l&#39;échantillon du foie, marquant le génotype n&#39;est pas affectée par cette différence de signal. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Un chromatogramme AFLP représentant (E31T32) tel qu&#39;il apparaît dans GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l&#39;ADN des tissus du foie, le chromatogramme du bas représente l&#39;ADN extrait de poils. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. Un représentant chromatogramme séquence d&#39;ADN mitochondrial (cytochrome b) tel qu&#39;il apparaît dans Sequencher v4.7 (Gene Code des sociétés). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l&#39;ADN des tissus du foie, le chromatogramme du bas représente l&#39;ADN extrait de poils. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Un marqueur sexage représentant moléculaire (ZFX / ZFY) amplifié à la fois pour le foie et les échantillons de cheveux. Cette approche repose sur l&#39;observation que le chromosome Y possède un site de restriction Hinfl dans cette région que le chromosome X manque. Ainsi, les femelles produisent deux co-migration des fragments de 432 pb alors que les mâles produisent des fragments de 432 pb, 261 pb et 171 pb.

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	<li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population.">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li><li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size,+natal+philopatry,+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+(Aquila+heliaca)+in+central+Asia.">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li><li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger.">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li><li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares.">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li><li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+(AFLP)+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395.">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li><li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+European+rabbits+(Oryctolagus+cuniculus),+European+brown+hares+(Lepus+europaeus)+and+mountain+hares+(Lepus+timidus)+with+ZFX+and+ZFY+loci.">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li><li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species.">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li><li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demographic+monitoring+of+an+entire+species+(the+northern+hairy-nosed+wombat,+Lasiorhinus+krefftii)+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material.">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li><li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails.">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li><li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika,+Ochotona+princeps.">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li></ol>

Non invasive l&#39;échantillonnage génétique est devenu une alternative intéressante aux méthodes traditionnelles de piégeage pour plusieurs raisons. D&#39;abord, en discrètement collecter du matériel biologique (par exemple, des excréments, poils, plumes, de salive et de mucus) à partir de populations sauvages, les chercheurs peuvent étudier ces espèces sans déranger, la manutention, ou même en les observant, réduisant ainsi les risques pour les animaux et les chercheurs. Deuxièmement, l&#39;échantillonnage génétique non invasif permet aux biologistes pour étudier les populations d&#39;espèces insaisissables et rares, une tâche qui peut s&#39;avérer difficile avec les plus traditionnelles approches de capture d&#39;animaux vivants 6. Et troisièmement, NGS peut potentiellement augmenter la taille des échantillons, en réduisant les perturbations pour les animaux, les efforts d&#39;échantillonnage, et les coûts, contribuant ainsi à minimiser les biais dans les estimations des paramètres de la population 7. Ce dernier point peut s&#39;avérer cruciale lorsqu&#39;il s&#39;agit d&#39;espèces menacées, puisque des estimations biaisées des paramètres de population peut aboutir à une gestion inappropriée. Dans l&#39;article, nous décrivons vidéo présente une méthode simple, un roman, peu coûteuse et non invasive pour l&#39;échantillon insaisissables petits mammifères, en utilisant le pica d&#39;Amérique comme un exemple. Nous démontrons que l&#39;ADN extrait de poils effectue la même façon que l&#39;ADN extrait d&#39;échantillons de foie à l&#39;égard de microsatellites, AFLP, marqueurs mitochondriaux et le sexage, ce qui rend cette méthode d&#39;échantillonnage non invasif une alternative intéressante à vivre d&#39;échantillonnage de piégeage ou mortelles. Globalement, nous prévoyons que cette méthode sera utile dans la phase de collecte des données des études de génétique des populations et de comportement des rares ou insaisissables espèces de petits mammifères, tout en minimisant l&#39;impact sur les organismes à l&#39;étude.

Piège des cheveux: <ul><li> Rouleaux de ruban d&#39;emballage transparent (3M, St. Paul, MN, USA) </li><li> Ligne de pêche (£ 10) </li><li> Le tube cryogénique (2 ml) </li><li> Pinces stériles </li><li> Dewar d&#39;azote liquide (facultatif) </li></ul> Extraction de l&#39;ADN: <ul><li> DNA IQ System (Cat. # DC6701; Promega) avec le tissu et kit d&#39;extraction de cheveux (Cat. # DC6740; Promega). </li><li> Technologie de séparation MagneSphere base magnétique (Cat. # Z5342; Promega) </li><li> Micro centrifugeuse </li><li> Four à hybridation ou de l&#39;eau du bain </li><li> 1,5 ml tubes Eppendorf </li></ul>

a noninvasive hair sampling technique to obtain high quality dna from elusive small mammals

Méthodes d&#39;échantillonnage non invasif génétiques sont de plus en plus important d&#39;étudier les populations fauniques. Un certain nombre d&#39;études ont déclaré utiliser des techniques d&#39;échantillonnage non invasif pour étudier la génétique des populations et la démographie des populations sauvages 1. Cette approche s&#39;est avérée être particulièrement utile lorsqu&#39;il s&#39;agit d&#39;espèces rares ou insaisissables 2. Bien qu&#39;un certain nombre de ces méthodes ont été développées pour les cheveux de l&#39;échantillon, les matières fécales et autres matières biologiques à partir des carnivores et mammifères de taille moyenne, elles sont largement restées non testée dans insaisissables les petits mammifères. Dans cette vidéo, nous vous présentons un roman, une caisse claire de cheveux peu coûteux et non invasif destiné aux petites insaisissable un mammifère, le pika américain (Ochotona princeps). Nous décrivons les réglages généraux de la caisse claire de cheveux, qui se compose de bandes de ruban d&#39;emballage, organisé de façon toile d&#39;araignée et placés le long voyage itinéraires dans l&#39;habitat du pika &quot;. Nous illustrons l&#39;efficacité du piège à collecter une grande quantité de cheveux qui peuvent ensuite être collectés et ramenés au laboratoire. Nous avons ensuite démontrer l&#39;utilisation du système de l&#39;ADN QI (Promega) pour isoler l&#39;ADN et de montrer l&#39;utilité de cette méthode pour amplifier couramment utilisé des marqueurs moléculaires microsatellites nucléaires, y compris, amplifié polymorphismes de longueur des fragments (AFLP), des séquences mitochondriales (800bp) ainsi que d&#39;un marqueur de sexage moléculaire. Globalement, nous démontrons l&#39;utilité de ce piège de cheveux non invasive roman comme une technique d&#39;échantillonnage pour les biologistes de la population faunique. Nous prévoyons que cette approche sera applicable à une variété de petits mammifères, le désenclavement des zones d&#39;investigation au sein des populations naturelles, tout en minimisant l&#39;impact pour les organismes d&#39;étude.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Nous présentons une approche d&#39;échantillonnage non invasive pour collecter efficacement les échantillons de cheveux de insaisissables petits mammifères, comme indiqué pour le pika américain. Nous démontrons l&#39;utilité de cette méthode par extraction d&#39;ADN à partir de cheveux prélevés et amplifiant plusieurs types de marqueurs moléculaires couramment utilisées dans les études sur l&#39;écologie de la faune et la conservation.

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

a-noninvasive-hair-sampling-technique-to-obtain-high-quality-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K vues.  University of British Columbia, Okanagan Campus. Nous présentons une approche d'échantillonnage non invasive pour collecter efficacement les échantillons de cheveux de insaisissables petits mammifères, comme indiqué pour le pika américain. Nous démontrons l'utilité de cette méthode par extraction d'ADN à partir de cheveux prélevés et amplifiant plusieurs types de marqueurs moléculaires couramment utilisées dans les études sur l'écologie de la faune et la conservation.

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Obtention d&#39;ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Recherche

Biologie

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Non invasive In Vivo Petits animaux IRM et SRM: base des procédures expérimentales

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Une méthode hybride d&#39;extraction d&#39;ADN pour l&#39;évaluation qualitative et quantitative des communautés bactériennes de la volaille Échantillons de production

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Une nouvelle technique pour l&#39;analyse quantitative de la perte de cheveux chez la souris Utilisation de l&#39;analyse des niveaux de gris

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological information. The pathways generated by this online application are machine-readable and fully compatible with essentially all web-browsers and computer operating systems. It uses a specially developed, web-enabled pathway drawing interface that permits the selection and placement of different combinations of pre-drawn biological or biochemical entities to depict reactions, interactions, transport processes and binding events. This palette of entities consists of chemical compounds, proteins, nucleic acids, cellular membranes, subcellular structures, tissues, and organs. All of the visual elements in it can be interactively adjusted and customized. Furthermore, because this tool is a web server, all pathways and pathway elements are publicly accessible. This kind of pathway &#34;crowd sourcing&#34; means that PathWhiz already contains a large and rapidly growing collection of previously drawn pathways and pathway elements. Here we describe a protocol for the quick and easy creation of new pathways and the alteration of existing pathways. To further facilitate pathway editing and creation, the tool contains replication and propagation functions. The replication function allows existing pathways to be used as templates to create or edit new pathways. The propagation function allows one to take an existing pathway and automatically propagate it across different species. Pathways created with this tool can be &#34;re-styled&#34; into different formats (KEGG-like or text-book like), colored with different backgrounds, exported to BioPAX, SBGN-ML, SBML, or PWML data exchange formats, and downloaded as PNG or SVG images. The pathways can easily be incorporated into online databases, integrated into presentations, posters or publications, or used exclusively for online visualization and exploration. This protocol has been successfully applied to generate over 2,000 pathway diagrams, which are now found in many online databases including HMDB, DrugBank, SMPDB, and ECMDB.

PathWhiz is a comprehensive, online pathway drawing tool for generating biochemical and biological pathways. It uses publicly accessible databases and easily expandable palettes consisting of pre-drawn pathway components. This protocol describes how to easily build new pathways, replicate and edit existing pathways, and propagate previously drawn pathways to different organisms.

Un outil Web pour la génération de haute qualité lisible par machine voies biologiques

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocole de microdissection de capture de laser qui donne l'ARN de haute qualité des os frais-congelés de souris

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...