We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Tissue Dissection et fixation (60 min) <ol><li> Pour cerveaux drosophile, placer 3 ème stade larvaire dans une goutte de 1x PBS (tampon phosphate salin). Choisissez grand stade larvaire 3 ème qui sont activement l&#39;exploration à partir des flacons ou des bouteilles qui ne sont pas surpeuplées. <ol><li> Utilisez une pince à épiler ultrafine paire de se emparer de la bouche des crochets et une autre paire de pince pour saisir 2/3 sur la longueur du corps (figure 1A, B). Tirez doucement sur la bouche crochets pour exposer le cerveau, les ganglions ventrale, glandes salivaires et une partie du tube digestif des larves. Utilisez la pince à épiler pour séparer le cerveau et les ganglions ventrale (figure 1A, B) des autres tissus et les placer dans une gouttelette de 1x PBT (tampon phosphate salin avec du Tween) sur une plaque de Petri en plastique. </li></ol></li><li> Pour Nasonia dissections des testicules, choisissez mâle 3-day-old pupes (corps jaune avec des yeux rouges). Homme Nasonia ont de petites longueurs de rembourrage d&#39;aile par rapport à females pendant le stade de pupe (figure 1C). <ol><li> Maintenez la nymphe en haut de l&#39;abdomen près de la région thoracique avec une paire de pince à épiler, et en utilisant l&#39;autre paire de pince à épiler, prenez la pointe distale de l&#39;abdomen et sortir les testicules en forme de larme (ils seront entourés par de la graisse corps qui peut être doucement secoué loin; figure 1D). Détachez les pièces extérieures de carrosserie des testicules, ce qui empêchera l&#39;écrasement bon, et le placer dans une gouttelette de 1x PBT sur une plaque de Petri en plastique. </li></ol></li><li> Pour chaque diapositive, disséquer un total de quatre ou cinq échantillons de tissus (ce est à dire., Drosophila cerveaux larvaires ou testicules Nasonia). NOTE: Plus de cinq échantillons mèneront à noyaux et les chromosomes surpeuplées. </li><li> Eventuellement, pour atteindre une certaine séparation des chromatides soeurs dans les régions euchromatiques de chromosomes mitotiques, traiter le tissu avec une solution hypotonique: transférer cerveaux de 1x PBT à une baisse de citrate de sodium à 0,5% pour les 5-10 (pas plus de 10) min. NOTE: La colchicine (un inhibiteur mitotique) peut être utile pour augmenter le nombre de figures de mitose à la métaphase 11. Cependant, son utilisation ne est pas nécessaire si très grand larves saines sont utilisés, et même souhaitable car elle peut nuire à la résolution des chromosomes, la diffusion et la morphologie. </li><li> Placer une goutte (~ 20 ul) de solution de fixation (2,5% de paraformaldehyde dans de l&#39;acide acétique à 45%) sur la surface d&#39;une lamelle couvre-Sigmacote traité propre. NOTE: Préparer une solution de fixateur frais pour chaque jour d&#39;utilisation. Solutions fixateur allant de 1,8 à 3,7% de paraformaldehyde dans de l&#39;acide acétique 45% donnent les meilleurs résultats pour les poissons. En utilisant des tissus autres que le cerveau ou les testicules, ou l&#39;adaptation de ce protocole pour immuno-FISH peut exiger expérimenter avec différents fixateurs (pour une liste des différents fixateurs, voir 12). </li><li> Transférer soigneusement chaque échantillon de tissu de la mémoire tampon de dissection (1x PBT) dans la gouttelette fixateur avec des pincettes ultrafines, minimizing le transfert de dissection tampon dans la solution de fixateur. Placer les échantillons de tissu de sorte qu&#39;ils sont uniformément espacés les uns des autres à l&#39;intérieur de la gouttelette fixateur. Incuber les tissus de fixateur pendant 4 min à température ambiante. </li><li> Placez délicatement une surface de glissement poly-lysine vers le bas sur le glissement des tissus et de la couverture. Ne appuyez pas à ce point, mais au lieu de permettre aux deux à contacter légèrement de sorte que la lamelle colle sur la face inférieure de la diapositive. Inversez la diapositive de sorte que la lamelle est sur le dessus. </li><li> Sandwich glissement coulissant / tissus / couvercle intérieur d&#39;un morceau de papier plié de filtre. Sur une surface stable, avec le pouce, appuyez fermement vers le bas sur la position directement au-dessus de la lamelle. Soyez prudent pour éviter un glissement latéral de la lamelle (cela va provoquer des bavures du tissu). </li><li> Immerger la diapositive / tissus / lamelle dans l&#39;azote liquide (voir appareil de la figure 1E, F), et laisser reposer jusqu&#39;à ce que le azote arrête bouillante (plus est fine). Retirer la lame et enclenchez immédiatement la lamelle avec une lame de rasoir propre en appuyant sur un coin de la lamelle dans une direction ascendante (éviter de rayer le tissu fixe avec la lame de rasoir). <ol><li> Pré-refroidissement de la lame / tissus / lamelle sur un bloc de glace sèche, lamelle jusqu&#39;à, pendant 1-2 min avant immersion dans l&#39;azote liquide aidera à prévenir les diapositives de la fissuration. </li></ol></li><li> Placer immédiatement la diapositive avec le tissu dans une jarre Coplin remplie d&#39;éthanol à 100% à la température ambiante et laisser reposer pendant au moins 5 minutes (ce temps peut être plus long si nécessaire). REMARQUE: éthanol à 100% froid pourrait également être utilisé. </li><li> Retirer la lame avec le tissu, évacuer excès d&#39;éthanol avec un Kimwipe (sans toucher le tissu fixe), et de laisser la lame sécher à l&#39;air pendant 1 heure. <ol><li> Passez directement à l&#39;étape 2 ou garder diapositives secs dans l&#39;air à basse humidité ou dans une chambre de dessiccation pendant des semaines voire des mois à avant d&#39;effectuer l&#39;hybridation. </li></ol></li></ol> Figure 1: (A) Un 3 ème stade larve de drosophile (à droite), avec des positions indiquées pour savoir où récupérer les crochets buccaux (notée avec *) et 2/3 de la descente de la larves de disséquer le cerveau; (À gauche) un schéma d&#39;une larve d&#39;un même stade de développement, représentant la position relative du cerveau dans la tête des larves. (B) Le cerveau et les ganglions ventrale disséqué d&#39;une 3 ème stade larve de drosophile (à droite) et un schéma de ce tissus (à gauche). (C) 3-day-old nymphe Nasonia au stade de l&#39;oeil du corps rouge jaune. (D) Une paire de testicule disséqué d&#39;un homme âgé de nymphe 3 jours Nasonia (à droite) avec des positions indiquant où saisir la nymphe à la partie postérieure de l&#39;abdomen (désigné par *) et à mi-chemin sur le corps; (À gauche) schématique mâle et femelle était dépeignantp pupes; pupes mâles se distingue par des ailes qui ne se étendent pas au-delà du profil sagittal (flèche noire), contrairement aux femelles, qui ont des ailes qui se étendent au-delà du profil; la position relative de la paire de testicule est montré dans la nymphe mâle. (E) L&#39;appareil-une chaîne de trombones-et méthode (F) utilisés pour immerger les lames dans un récipient d&#39;azote liquide. Plusieurs chaînes de trombone peuvent être utilisés pour l&#39;immersion simultanée de plusieurs diapositives. 2. Hybridation in situ (30 min le jour 1; 1 h-2,5 heures pendant de longues sondes sur deux jours) <ol><li> Ajouter 1 pi (100 ng) de chaque sonde de 20 ul de tampon d&#39;hybridation 1,1x. Pipet sonde / tampon d&#39;hybridation sur la surface du tissu fixe (éviter de toucher le tissu). </li><li> Placez délicatement une lamelle directement sur le tampon sonde / hybridation, faire en sorte que la lamelle est centré directement sur le tissu. Le tampon doit migrer vers the bord extérieur de la lamelle, ne laissant aucune bulles d&#39;air. NOTE: Les petites bulles qui ne contactent pas les tissus ne pose pas de problèmes à la procédure. Retirer les grosses bulles en soulevant délicatement un coin de la lamelle et soigneusement laisser tomber en arrière sur la diapositive. </li><li> Placez le glissement coulissant / tissus / couvercle sur la surface d&#39;un bloc pré-chauffé à 95 ° C (couverture glisser vers le haut). Couvrir avec un grand morceau de papier d&#39;aluminium pour éviter exposition à la lumière. Laissez la diapositive incuber à 95 ° C pendant 5 min. REMARQUE: Un bloc de chaleur typique avec des trous pour les tubes peut être retourné pour fournir une surface plane sur laquelle placer la diapositive / tissus / lamelle. </li><li> Retirer la lame, le laisser refroidir légèrement jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit chaud au toucher. Envelopper soigneusement un morceau de Parafilm étiré autour de la lamelle pour sceller le liquide en dessous. </li><li> Placer la lame scellé à l&#39;intérieur d&#39;une chambre d&#39;humidité et placer la chambre dans un incubateur préchauffé à 30 ° C. Incuber à 30 ° C pendant 4 heures à une nuit.<ol><li> Créer une chambre humide à partir d&#39;une boîte de pointe vide ou un récipient à couvercle de Tupperware avec Kimwipes mouillées ou des serviettes en papier placés au fond. REMARQUE: Les sondes ADN simples brins oligonucléotidiques ont été conçues pour être de 28 à 33 bases pour atteindre une température de fusion théorique (T m) de 45 à 47 ° C. Ces longueur et T m fourchettes reflètent le fait que beaucoup de séquences répétitives que nous avons étudiés sont AT-riche et donc très faible teneur en GC. Des sondes plus longues auront probablement des valeurs plus élevées de m T; il peut en résulter une hybridation ultérieure de fond à la température d&#39;hybridation standard de 30 ° C. Ainsi, un peu de dépannage avec des températures d&#39;hybridation peut être nécessaire pour obtenir les meilleurs résultats. Pour trouver la meilleure température d&#39;hybridation, augmentation (ou diminution) de la température de 5 ° C, progressivement. </li></ol></li><li> Retirez délicatement le Parafilm de la diapositive, puis retirez soigneusement la lamelle en soulevant lentement un coin. Washingtonsh la diapositive trois fois pour 15 minutes chaque lavage dans un tampon SSC 0,1x. Couvrir la jarre de Coplin avec du papier d&#39;aluminium pendant les lavages à minimiser exposition à la lumière. </li><li> Si vous ne utilisez pas une longue sonde biotinylée, passez à l&#39;étape 2.8. <ol><li> Si vous utilisez une sonde à long biotinylé, sécher la zone autour du tissu avec un Kimwipe, en faisant attention de ne pas toucher le tissu lui-même. Placez 100 pi de solution de blocage sur le tissu et recouvrir délicatement avec une lamelle, en prenant soin d&#39;éviter les bulles de piégeage. Enveloppez la lame sur la lamelle avec du Parafilm et lieu à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Retirez délicatement la lamelle et épongez autour du tissu avec un Kimwipe. Distribuer 100 ul de la rhodamine-avidine diluée 1: 1000 dans les soins SBT sur le tissu et recouvrir délicatement avec une lamelle, en prenant pour éviter la formation de bulles. Enveloppez la lame sur la lamelle avec du Parafilm et lieu à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Retirez délicatement la lamelle et laver la lame 3 fois pendant 5 minutes chacun dans 4x SSCT puis3 fois pendant 5 min chacun dans 0,1x SSC. REMARQUE: Les diapositives peuvent être lavé pendant des périodes de temps plus longues. </li></ol></li><li> Retirer la lame et épongez autour du tissu avec un Kimwipe sec pour enlever l&#39;excès de tampon (éviter de toucher le tissu). Placez le côté tissu de glisser vers le haut dans un endroit sombre pendant 10-15 min ou jusqu&#39;à ce que l&#39;humidité se dissipe complètement. </li><li> Pipeter 11 ul de milieu de montage Vectashield (avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole-DAPI) sur le tissu. Placez délicatement une lamelle propre (pas traité avec Sigmacote) directement sur le centre du milieu de montage et de tissus. Le milieu de montage devrait migrer lentement vers l&#39;extérieur vers les bords de la lamelle. NOTE: Si le milieu de montage ne parvient pas à atteindre le bord de la lamelle sur tous les côtés, puis un 1-2 ul supplémentaire de milieu de montage peut être appliquée à une position au bord de la lamelle à remplir le volume nécessaire. Dans ce cas, veillez à essuyer tout excès du milieu de la surface de glissement avantétanchéité. </li><li> Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Évitez de peindre le vernis à ongles sur l&#39;échantillon de tissu. </li><li> Placer la lame en position verticale dans un endroit sombre et laisser le vernis à ongles à sec jusqu&#39;à ce que complètement dur (généralement 30 minutes ou plus). À ce stade, l&#39;image du tissu ou de conserver à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 1 semaine pour l&#39;imagerie tard. </li></ol> Buffer / Recettes Solution 10x PBS <ul><li> 80 g de NaCl </li><li> 2,0 g de KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g de KH 2 PO 4 </li><li> pH à 7,4, H 2 O de 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml de PBS 10x </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g de NaCl </li><li> 88,2 g de citrate de Na </li><li> dans 800 ml de H 2 O </li><li> pH à 7, H 2 O à 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Mélange d&#39;hybridation (20 pi; modifié à partir 11) <ul><li> 10 ul de formamide </li><li> 4 ul de 50% de sulfate de dextrane </li><li> 2 ul 20x SSC </li><li> 4 ul de H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g de sérumalbumine bovine (BSA) </li><li> 10 pi de Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> 8 La solution de blocage (10 ml) <ul><li> 0,3 g de BSA </li><li> 10 pi de Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml de H 2 O </li></ul> Solution de fixation au paraformaldéhyde (1 ml) <ul><li> 393,75 pi H 2 O (ajouter de l&#39;eau en premier) </li><li> 450 ul d&#39;acide acétique glacial </li><li> 156,25 ul 16% de paraformaldehyde </li></ul>

<ol>
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H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

ADN ISH est fréquemment utilisé pour cartographier des séquences spécifiques à chromosomes. Nous avons décrit une méthode simple pour l&#39;ADN ISH optimisé pour nombre élevé de copies, séquences hétérochromatiques. Plutôt que d&#39;utiliser des lavages dans une solution de formamide, ce qui est une exigence dans d&#39;autres protocoles ADN ISH existants, on place les lames de tissus montés directement sur un bloc de pré-chauffé pour dénaturer l&#39;ADN. Ce procédé évite l&#39;utilisation de grandes...

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Sondes aux régions à copie unique dans euchromatine peuvent être générés par une poignée d&#39;approches, y compris translation de coupure ou la fin-étiquetage des produits de 1,2 ADN longues et l&#39;incorporation de deoxygenin (DIG) nucléotides -attached et leur reconnaissance à travers une grande variété de conjugué anticorps-groupe 1-3. Visualisation des séquences euchromatiques dans peu ou seul numéro de copie nécessite l&#39;utilisation soit simples, grandes sondes ayant une activité spécifique élevée ou un cocktail de plusieurs petites sondes, qui améliorent collectivement signaux. En revanche, les séquences hautement répétitives trouvés dans hétérochromatine, comme ADN satellites, sont des cibles plus faciles pour l&#39;ADN ISH parce qu&#39;ils existent normalement que des dizaines de milliers de répétitions groupées dans les régions chromosomiques simples appelés blocs. Les éléments transposables peuvent également êtretrouvé à grand nombre de copies à distincte loci chromosomiques 2. Dans ces cas, les sondes simples avec faible activité spécifique peuvent effectivement étiqueter séquences hétérochromatiques en raison de leur hybridation à plusieurs sites. Sondes à séquences répétitives peuvent être synthétisés oligonucléotides commercialement aussi courtes (30-50 pb) et chimiquement conjugués avec une des multiples différents groupes fluorescents. Cartographie de séquences répétitives au sein hétérochromatine en utilisant des technologies de séquençage des génomes est difficile en raison de difficultés rencontrées dans les échafaudages de construction dans les blocs de satellites hautement répétitives 4-6,7. Actuellement, ISH se présente comme le moyen le plus efficace de la cartographie de ces séquences au niveau des sous-chromosome. Cette stratégie est importante pour cartographier un grand nombre de séquences répétitives qui sont découverts par des études génomiques et de séquençage du transcriptome en cours. L&#39;efficacité et la facilité de cartographie des séquences répétitives sur les chromosomes de diapositives montées seraient GREatly renforcée par un protocole simplifié pour l&#39;ADN ISH. Par exemple, les protocoles existants pour l&#39;ADN ISH impliquent de multiples lavages de tissus hybrides en solution formamide 2,8, ajoutant ainsi sensiblement au temps requis pour les séquences de cartographie et de produire de grandes quantités de déchets chimiques pour ce réactif coûteux. Nous décrivons ici un procédé ADN ISH révisé qui contourne la nécessité de lavages formamide et utilise le matériel et les réactifs de laboratoire de base. Cette méthode a été initialement conçu pour la cartographie rapide de séquences d&#39;ADN hautement répétitives dans des régions hétérochromatiques neuroblastes larves de Drosophila en utilisant les oligos de synthèse dans le commerce qui sont conjugués avec des colorants fluorescents. Cependant, cette méthode fonctionne également pour mettre en correspondance des séquences répétitives en utilisant de plus grandes sondes synthétisées par d&#39;autres moyens et 9,10 dans de multiples types de tissus et de chromosomes différents. En outre, cette méthode peut être utilisée pour cartographier des séquences euchromatiques en utilisant plus ou Multiple, de courtes sondes dans la séquence euchromatique d&#39;intérêt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Cette approche est particulièrement efficace pour la cartographie des séquences hautement répétitives à des régions hétérochromatiques, où les approches de calcul face à des défis prohibitifs. Ici, nous décrivons un protocole simplifié pour l&#39;ADN ISH qui contourne lavages formamide qui sont des mesures standard dans d&#39;autres protocoles ADN ISH. Notre protocole est optimisé pour l&#39;hybridation avec de courtes sondes d&#39;ADN simple brin qui transportent des colorants fluorescents, qui marquent efficacement des séquences d&#39;ADN répétitives à l&#39;intérieur des régions chromosomiques hétérochromatiques dans un certain nombre de types de tissus de différents insectes. Toutefois, les applications peuvent être étendues à utiliser avec des sondes et la visualisation de séquences d&#39;ADN copie unique (non répétitive) grands. Nous démontrons cette méthode en cartographiant plusieurs différentes séquences répétitives à des chromosomes de Drosophila melanogaster écrasés cellules neurales et Nasoniavitripennis spermatocytes. Nous montrons schémas d&#39;hybridation pour les deux petites sondes, synthétisées dans le commerce et pour une plus grande sonde pour comparaison. Cette procédure utilise des consommables et réactifs de laboratoire simples, et est idéal pour les enquêteurs qui ont peu d&#39;expérience avec l&#39;exécution de l&#39;ADN ISH.

Pour illustrer cette méthode, nous avons hybridé un ensemble de petits oligos synthétisés dans le commerce qui ont été modifiés chimiquement avec des conjugués fluorescents (figure 2) et une sonde plus biotinylé (fait par translation de coupure d&#39;un produit PCR; Figure 2B), les chromosomes de plusieurs tissus différents types (voir le tableau 1). Les séquences cibles incluses répétitions satellites situés dans les régions péricentromériques (hétér...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

17.9K vues.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Recherche

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Un débit élevé In situ</emMéthode d&#39;hybridation> pour caractériser les modes d&#39;expression d&#39;ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

ADN-ARN combiné Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...