Nous reconnaissons l&#39;appui par l&#39;École des sciences de l&#39;informatique et de la Faculté des Sciences, de l&#39;Agriculture et de génie Université de Newcastle, par l&#39;Université d&#39;Ulm, et par la SA SciMedia (Tokyo, Japon).

1. Préparation du crabe du système nerveux Stomatogastric Adult Cancer pagurus L. ont été obtenus auprès de sources locales (Université de Newcastle, Dove Marine Laboratories) et conservés dans filtré, eau de mer aérée (10 - 12 ° C). Les animaux ont été anesthésiés par les emballer dans de la glace pendant 20 - 40 min avant la dissection. Nous avons utilisé isolés stomatogastric systèmes nerveux (STNS) 1. Le STNS était coincé dans un élastomère de silicone-alignés (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Munich, Allemagne) boîte de Pétri et continuellement perfusées (7 - 12 mL / min) avec une solution saline réfrigérée (10-13 ° C). Sérum physiologique se composait de (mmol * L-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; Trisma de base, 10; acide maléique, 5. Saline a été maintenu à une température constante de 11 - 13 ° C et à pH 7,4 - 7,6. Les étapes détaillées de la dissection STNS et de préparation, y compris le dégainage du ganglion stomatoastric (STG), sont présentés dans l&#39;article JoVE par Guttierez et Grashow 1. Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec la directive des Communautés européennes du 24 e 1986 Novembre (86/609/CEE). La figure 1A montre un diagramme schématique de la figure 1B STNS et montre une STG typiques desheathed ayant ses neurones disposés comme un demi-cercle à plat dans la partie postérieure du ganglion. La boîte de Pétri avec le STNS est fixé à la plate-forme d&#39;exploitation de l&#39;imagerie au microscope (BW51 WI; Olympus, Tokyo, Japon) avec la pâte à modeler. Tous les deux, la platine du microscope et la loupe sont montés sur une table de vibration isolée (Scientifica, Uckfield, Royaume-Uni) afin d&#39;éviter les artéfacts de mouvement lors de l&#39;enregistrement optique. Les schémas moteurs générées dans le ganglion stomatogastric (STG) sont suivis en utilisant des enregistrements extracellulaires 2-4. Ceci est fait par les étapes suivantes: <ol><li> Un compartiment de gelée de pétrole à base cylindrique est construite autour d&#39;une section du nerf moteur principal (LVN) pour isoler électriquement le nerf de la baignoire (cela se fait sur ​​la scène de dissection avant la boîte de Pétri est placé sur la plate-forme d&#39;exploitation de l&#39;imagerie au microscope ). </li><li> Un des deux fils électrodes inox acier est placé dans ce compartiment, l&#39;autre dans le bain comme une électrode de référence. </li><li> Le signal différentiel est enregistré, filtré et amplifié par un amplificateur différentiel AC (Univ. Kaiserslautern, Allemagne). </li><li> L&#39;activité motrice du ganglion est contrôlée au moyen d&#39;un oscilloscope (DL708E; Yokogawa, Tokyo, Japon) et est en outre enregistré en utilisant une carte d&#39;acquisition de données (alimentation DEC, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) et le Spike 2 v6.10 logiciel (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Les fichiers sont analysés à l&#39;aide de Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Préparation de la solution de colorant Nous avons utilisé le fluorescentes sensibles au voltage de teinture Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, qui a une double charge positive qui facilite le chargement du colorant à travers microélectrodes en utilisant des impulsions de courant positives. La solution de colorant doit être protégé de la lumière autant que possible. La solution de colorant est préparé comme suit: <ol><li> 5 mg de colorant est mélangé avec 1 ml d&#39;acide Pluronic F-127 dans le DMSO (Invitrogen) solution. </li><li> Le flacon en plastique contenant le colorant dissous est centrifugé pendant 20 minutes à 12 000 rotation / minute dans une microcentrifugeuse Sigma 1-14 (Sigma, Osterode, Allemagne) afin de séparer des particules de colorant grands qui peuvent obstruer les microélectrodes. </li><li> Le surnageant (Top 200 pi) de la solution de colorant est séparé à l&#39;aide d&#39;une pipette et stockés dans un flacon en plastique séparé. Les deux flacons sont emballés dans du papier aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> La solution de colorant est congelé à -20 ° C. </li><li> Avant d&#39;utiliser la solution de colorant est fondu en plaçant le flacon fermé et enveloppé dans chaude (25 ° C) de l&#39;eau pendant 10-15 minutes. </li></ol> 3. Chargement colorant par injection intracellulaire aide de microélectrodes de Sharp Nous avons utilisé des microélectrodes forte pour charger les neurones avec le colorant. Pour vérifier le colorant de charge, nous utilisons le système d&#39;imagerie MiCAM02 (SciMedia, Tokyo, Japon) 6. Le système d&#39;imagerie possède deux caméras CCD: la caméra RH a une puce capteur plus grand (6,4 mm x 4,8 mm) offrant une meilleure résolution spatiale avec la meilleure résolution temporelle étant de 1,4 ms, la caméra HS a un plus petit (2,9 mm x 2,1 mm), mais rapide puce de capteur permettant rapidement d&#39;imagerie ayant 0,7 ms comme sa meilleure résolution temporelle. Les étapes du colorant de charge sont les suivants: <ol><li> Microélectrodes sont tirés avec un P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) Extracteur d&#39;électrodes à l&#39;aide de 10 cm de long, 1 mm de diamètre externe des tubes de verre avec filament (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Allemagne). Les électrodes sont tirés d&#39;avoir une résistance à lagamme de 25 à 40 MOhm en 3M KCl (pour les réglages des paramètres appropriés tirant suivre le livre de la pipette fournie par le fabricant de l&#39;extracteur d&#39;électrode). </li><li> La solution de colorant congelé est fondu et une très petite quantité de celui-ci est aspiré dans une aiguille Microfil (Microfil - 34G, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, USA) - le colorant aspirée remplit autour ème 2 / 3 de l&#39;aiguille Microfil . </li><li> La solution de colorant dans l&#39;aiguille Microfil est injecté dans l&#39;extrémité d&#39;une microélectrode. La microélectrode est placée dans une boîte sombre pendant 15 minutes. </li><li> La microélectrode est remblayé avec 3M KCl solution. L&#39;électrode est ensuite replacée dans une boîte de rangement pour une autre électrode noire 10-20 minutes pour permettre à la solution de colorant pour atteindre la pointe fine de l&#39;électrode par l&#39;aspiration de la force capillaire agissant dans la microélectrode. </li><li> La microélectrode prêts est placé dans un porte-électrode et fixé sur la headstage de l&#39;amplificateur intracellulaire (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA). </li><li> L&#39;amplificateur intracellulaire est connecté à la carte d&#39;acquisition de données qui fournit un signal d&#39;impulsion pour conduire les impulsions de courant dans la microélectrode. </li><li> La microélectrode est placé délicatement dans la membrane d&#39;un neurone à l&#39;aide d&#39;un manipulateur STG microélectrode (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, Royaume-Uni). Comme la distance de travail de l&#39;objectif 10x (UMPLFL10XW, NA 0.30, WD 3.3mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japon) du microscope d&#39;imagerie est très faible, la microélectrode doit être placé dans une position oblique (environ 30 °) et le mouvement de la microélectrode dans la bonne position nécessite plusieurs étapes de re-focalisation de l&#39;objectif du microscope et en déplaçant les microélectrodes. Pour lancer la microélectrode est déplacée dans une position telle que son extrémité se trouve au-dessus du STG. L&#39;objectif de microscope est abaissé jusqu&#39;à la pointe de l&#39;électrode apparaît au point. Puis il est descendu encore, mais pas autant toucher la microélectrode. La microélectrode est abaissée jusqu&#39;à ce qu&#39;il réapparaisse dans le foyer de l&#39;objectif. Ces étapes sont répétées jusqu&#39;à ce que les neurones apparaissent clairement dans le plan focal de l&#39;objectif. Puis la microélectrode est abaissé jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche et perce délicatement la membrane du neurone STG sélectionnés. Ceci est surveillé à l&#39;aide de l&#39;oscilloscope. </li><li> L&#39;électrode intracellulaire est utilisée pour enregistrer l&#39;activité du neurone STG sélectionnés afin d&#39;identifier le neurone donné son profil d&#39;activité et la relation entre son activité et l&#39;activité enregistrée STG de l&#39;électrode extracellulaire 2,3,7. </li><li> L&#39;amplificateur intracellulaire est commuté en mode d&#39;injection de courant et est utilisé pendant 30 minutes pour injecter 10 nA mesures positives en cours dans la microélectrode qui durent 1 seconde et sont séparés par une seconde sans lacunes courant injecté dans la microélectrode. Les lecteurs du courant injecté molécules chargées positivement colorant dans le neurone enregistré. Si l&#39;équipement est disponible neurones multiples peuvent être injectés simultanément. </li><li> Dix minutes après la période d&#39;injection et après la fin de l&#39;injection de la propagation de teinture dans le neurone est cochée. Pour ce faire nous utilisons le système d&#39;imagerie MiCAM02 (SciMedia Ltd, Tokyo, Japon) avec l&#39;objectif 10x et l&#39;illumination par la source ultra-faible ondulation de lumière halogène (HL-151; MORITEX, Tokyo, Japon) à travers le cube de MSWG2 filtre (avec 480-550 nm d&#39;excitation du filtre; Olympus Corporation, Tokyo, Japon). Le système d&#39;imagerie est configuré pour utiliser la caméra HR avec 192 x 128 pixels résolution, 40 ms imagerie en temps, le mode &#39;hbin&#39;, et 10 images par séance d&#39;imagerie. Si le remplissage de teinture est réussie, l&#39;imagerie doit montrer un patch teints dans le neurone autour de l&#39;emplacement de la microélectrode, et ce patch devrait teints poussent entre les images prises après 10 minutes et après 30 minutes. Si la propagation de la teinture est insuffisante après 30 minutes, le temps d&#39;injection plus est accordée. Alternativement, une électrode de nouveau colorant peuvent être utilisés. </li><li> L&#39;électrode est sorti du neurone et le neurone est laissé à reposer pendant au moins 20-30 minutes. Dans ce temps, le neurone suivant peut être injecté avec la teinture. </li></ol> 4. Imagerie des neurones Teints L&#39;activité des neurones simples peuvent être visualisés après la procédure de teinture de remplissage. Alternativement deux ou plusieurs neurones peuvent être remplis à l&#39;image de l&#39;activité simultanée des neurones STG plusieurs années. En principe, de nombreux et, éventuellement, tous les neurones STG peut être rempli avec de la teinture. L&#39;imagerie des neurones se fait avec le système d&#39;imagerie MICAM 02 utiliser l&#39;appareil photo RH. La procédure d&#39;imagerie est comme suit: <ol><li> L&#39;objectif de microscope est changé et une transmission à haute efficacité lumineuse 20x objectif (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japon) est utilisé pour la collecte des données d&#39;imagerie. Cet objectif recueille beaucoup plus de lumière que l&#39;objectif 10x et donne également un plus fort grossissement offrant une image plus détaillée des neurones. Bein<html> g plus de lumière que les moyens efficaces petite quantité de colorant de charge est déjà visible avec cet objectif et aussi que nous pouvons utiliser la lumière d&#39;intensité plus faible pour l&#39;imagerie réduire les dommages potentiels de photos qui peuvent être causés aux neurones par le colorant. </li><li> Phase d&#39;exploitation du microscope est positionné de telle sorte que les neurones qui sont destinés à être imagé sont dans le champ de vision de l&#39;objectif et l&#39;objectif est focalisé sur eux. </li><li> Les données d&#39;enregistrement extracellulaire est également introduite dans le système d&#39;imagerie MICAM 02 grâce à son canal d&#39;entrée analogique. Cela permet à la facilité relative relatives des signaux optiques et des schémas moteurs correspondants ou les pointes enregistrées dans le milieu extracellulaire phase d&#39;analyse. </li><li> Le système MICAM 02 est configuré pour utiliser la résolution 96 x 64 pixels avec 2,2 ms de temps d&#39;imagerie ou de 48 x 32 pixels résolution avec 1,5 ms imagerie en temps. Dans les deux cas, le «hbin« réglage peut être utilisé si la teinture des neurones n&#39;est pas très forte. </li><li> Le niveau d&#39;éclairage est fixé aussi bas que possible (c&#39;est à dire le colorant dans les neurones devrait générer encore de fluorescence suffisante pour l&#39;imagerie) afin d&#39;éviter de photos de modulation et de dommages photo de neurones enregistrés. </li><li> L&#39;éclairage de la pièce et de toutes les sources lumineuses qui restent sont désactivés. De plus, un rideau noir peut être fermé autour du gréement pour empêcher l&#39;enregistrement exposition à la lumière provenant de sources externes. </li><li> Les séances d&#39;imagerie sont configurés pour être entre 4 - 16 secondes de long. </li><li> L&#39;activité spontanée des neurones teints sont enregistrés sur plusieurs séances d&#39;imagerie. </li></ol> 5. L&#39;analyse des données d&#39;imagerie optique Pour analyser les données d&#39;imagerie, nous avons utilisé le logiciel BVAna (version 10.08; SciMedia Ltd, Tokyo, Japon) associé à l&#39;MICAM 02 système d&#39;imagerie. Le logiciel supporte la visualisation des données d&#39;imagerie et fournit une gamme d&#39;outils d&#39;analyse ainsi. Les étapes de l&#39;analyse des données et l&#39;interprétation sont comme suit: <ol><li> Une région appropriée circulaires d&#39;intérêt est sélectionné sur chaque neurones enregistrés. Typiquement, nous utilisons 2 - 3 régions rayon de pixel d&#39;intérêt pour enquêter sur les neurones à la résolution 48 x 32 pixels, et 6 - 8 régions rayon de pixel d&#39;intérêt pour enquêter sur les neurones à 96 x 64 résolution. </li><li> Le lissage temporel des données peut être nécessaire, surtout si le colorant génère quantité relativement faible de la fluorescence (valeur faible bruit de fond dans les données indique que cela, elle peut être à cause du niveau faible lumière qui est utilisée ou à faible niveau de colorant de charge, par exemple dans un neurites des neurones enregistrés). Habituellement, dans de tels cas, nous avons utilisé un lissage temporel avec 3 à 5 unités de temps. </li><li> En plus des enregistrements optiques, nous aussi afficher l&#39;enregistrement extracellulaire en sélectionnant pour afficher l&#39;entrée analogique du système d&#39;imagerie. </li><li> Les paramètres pour la visualisation des données optiques et l&#39;entrée analogique doit être réglé de façon appropriée afin de voir tous les enregistrements sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li><li> Considérant les enregistrements optiques des neurones, l&#39;enregistrement extracellulaire de l&#39;ISA, et la classification du neurone basée sur l&#39;enregistrement intracellulaire tôt, il est possible de déterminer l&#39;identité du neurone et de relier son activité à l&#39;activité neuronale enregistrées à partir du nerveuses. </li><li> Il est prévu que les enregistrements optiques montrent clairement, et sans la nécessité de l&#39;étalement sur plusieurs événements similaires, les activités neuronales correspondant aux pics enregistrés et extracellulaire aussi des événements tels que infraliminaire inhibiteurs potentiels post-synaptiques causés par l&#39;activité des autres neurones. </li><li> Les caractéristiques des données d&#39;exportation des logiciels BVAna peut être utilisé pour exporter les enregistrements optiques calculées pour les régions d&#39;intérêt sélectionnées et l&#39;entrée analogique qui contient l&#39;enregistrement de la LVN. Les données exportées peuvent être traitées et analysées plus loin en utilisant d&#39;autres logiciels d&#39;analyse de données ainsi que (par exemple dans le cas le plus simple de Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Etats-Unis) peut être utilisé pour la visualisation et le traitement des données supplémentaires). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs La figure 2 montre l&#39;enregistrement simultané de deux neurones (LP, latéral pylorique neurone; PD, pylorique dilatateur neurone) dans le générateur de motif central du pylore d&#39;un crabe STG combiné avec l&#39;enregistrement de la LVN. Les enregistrements optiques des neurones LP et PD identifiés sur la base de leurs enregistrements intracellulaires montrent que ceux-ci correspondent en effet bien avec les enregistrements extracellulaires des neurones correspondant à LP et PD. Il ya un uniforme 12 ms de retard entre les enregistrements optiques et lvn des pics de pointe (voir encart de la figure 2) en raison du retard de transmission axonale entre le ganglion et le site d&#39;enregistrement extracellulaire. Les données présentées montrent également que l&#39;activité neuronale dans le soma qui correspond à des pointes de neurones enregistrés est clairement détectable. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figure 1 &quot;/&gt; Figure 1. Un schéma) Schéma du système nerveux stomatogastric (STNS). COG, ganglion commissural; OG, le ganglion œsophagien; STG, le ganglion stomatogastric; STN, nerf stomatogastric; LVN, nerf du ventricule latéral. B) Le ganglion de crabe stomatogastric (STG) - l&#39;image montre la disposition semi-circulaire postérieur de neurones STG. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Enregistrement simultané simple balayage d&#39;une DP et un neurone LP combiné avec l&#39;enregistrement de l&#39;IVL. Les données montrent que le nerf optique et des enregistrements correspond très bien et que nous pouvons identifier les activités neuronales correspondant aux pics enregistrés forment le nerf. L&#39;encart montre une superposition de plusieurs balayages de potentiels d&#39;action LP - deux optiquement et électriquement enregistrées - et leur moyenne démontrant l&#39;adéquation entre l&#39;optique et des activités électriquement enregistrées. En raison du fait que notre méthode d&#39;enregistrement optiques ne filtre pas les composants de basse fréquence des données que nous sommes également en mesure d&#39;enregistrer des changements lents potentiel membranaire caractéristique de PD et LP neurones 14.

<ol>
	<li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition.">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li><li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+pattern+selection+via+inhibition+of+parallel+pathways.">Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways.</a> J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).</li><li>Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+activity-dependent+synaptic+enhancement+at+a+crustacean+neuromuscular+junction.">Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction.</a> J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).</li><li>Loew, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+dyes:+Imaging+electrical+activity+of+cell+membranes.">Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes.</a> Pure &#38; Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).</li><li>Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab,+Cancer+pagurus:+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination.">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li><li>Zecevic, D., Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., London, J. A., H&#246;pp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex.">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors.">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).</li><li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation.">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs.">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).</li><li>Grillner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+pattern+generation:+the+cellular+and+computational+logic+of+networks+in+motion.">Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion.</a> Neuron. 52, 751-766 (2006).</li><li>Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortex+as+a+central+pattern+generator.">The cortex as a central pattern generator.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).</li><li>Stein, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+stomatogastric+rhythms.">Modulation of stomatogastric rhythms.</a> J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).</li></ol>

Le colorant sensible au voltage d&#39;imagerie 8,9 de STG neurones en combinaison avec des méthodes classiques d&#39;électrophysiologie (enregistrements d&#39;électrodes intra-et extracellulaire) permet une meilleure compréhension de la façon dont ce petit bien connu et toujours complexe fonctionne le système neuronal. Le STG est un prototype de centrale électrogène pattern (CPG) des réseaux neuronaux (il comprend les réseaux pylorique et gastrique rythme du moulin) 10, 11, donc une meilleure compréhension des propriétés émergentes fonctionnelle de la STG aidera également à comprendre comment, en général réseaux CPG génèrent leurs fonctionnalités au niveau du réseau. CPG réseaux jouent un rôle crucial dans le contrôle moteur 12 et également dans les fonctions cognitives supérieures 13, par conséquent, la meilleure compréhension de leurs propriétés émergentes peuvent avoir un impact majeur dans de nombreux domaines de la neuroscience.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MiCAM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia Ltd, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>BVAna v.10.08</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia, Tokyo, Japab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>HL-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Moritex, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra-low ripple halogen light source</td>
</tr>
<tr>
<td>BX51 WI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upright microscope for epifluorescence imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>20x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>XLUMPLFL20XW/0.95</td>
<td>NA 0.95, WD 2.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>10x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>UMPLFL10XW</td>
<td>NA 0.30, WD 3.3mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>MSWG2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antivibration table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>63-534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PatchStar electrode manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>PS-7000C</td>
<td>Micro-electrode manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>CED Power 1401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data acquisition board</td>
</tr>
<tr>
<td>DL708E Oscilloscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>AC differential amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Kaiserslautern, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97 Flaming &#x2013; Brown type electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrode puller</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Osterode, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Centrifuge</td>
</tr>
<tr>
<td>Genex Pipettors Mline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
<td>PIP7774</td>
<td>PIP7774</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass micropipette with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
<td>GB100TF 8P</td>
<td>Glass for microelectrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>MicroFil &#x2013; 34G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microfil needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Spike 2 v6.10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrophysiology software</td>
</tr>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK</td>
<td>BT61014</td>
<td>Fluorescent voltage sensitive dye</td>
</tr>
<tr>
<td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Paisley, UK</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>Solvent</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>S9888</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2 . 2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>C3881</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>P3911</td>
<td>Crab saline component, electrolyte solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2 . 6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M9272</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Trizma base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>T1503</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M0375</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Elastosil RT-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wacker, Munich, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lining of Petri dishes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical imaging of neurons in the crab stomatogastric ganglion with voltage-sensitive dyes

Sensibles au voltage d&#39;imagerie colorant de neurones est une méthode clé pour la compréhension de la façon dont les réseaux neuronaux sont organisés et comment l&#39;activité simultanée des neurones qui participent conduit à l&#39;émergence de la fonctionnalité intégrale du réseau. Nous présentons ici la méthodologie d&#39;application de cette technique pour générer des neurones schéma identifié dans le ganglion de crabe stomatogastric. Nous démontrons le chargement de ces neurones avec les fluorescents sensibles au voltage de teinture Di-8-ANEPPQ et nous montrer comment l&#39;image de l&#39;activité de teinture neurones chargés à l&#39;aide de la vitesse élevée et MiCAM02 CCD haute résolution caméra d&#39;imagerie du système. Nous démontrons l&#39;analyse des données d&#39;imagerie a enregistré en utilisant le logiciel d&#39;imagerie BVAna associés au système d&#39;imagerie MiCAM02. Le simultanée sensibles au voltage d&#39;imagerie de l&#39;activité de teinture détaillée des neurones dans le ganglion plusieurs crabes stomatogastric appliqué conjointement avec les techniques traditionnelles de l&#39;électrophysiologie (enregistrements intracellulaires et extracellulaires) ouvre radicalement nouvelles opportunités pour la compréhension de la façon dont le travail générateur de pattern centrale réseaux neuronaux.

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Nous présentons ici la méthodologie utilisée pour la résolution rapide et de haute fluorescentes sensibles au voltage d&#39;imagerie de l&#39;activité de teinture détaillée des neurones dans le ganglion stomatogastric crabe.

Imagerie optique des neurones dans le ganglion de crabe Stomatogastric avec tension colorants sensibles

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K vues.  Ulm University. Nous présentons ici la méthodologie utilisée pour la résolution rapide et de haute fluorescentes sensibles au voltage d'imagerie de l'activité de teinture détaillée des neurones dans le ganglion stomatogastric crabe.

Vidéo: Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Recherche

Neurosciences

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Enregistrement colorant sensible à la tension d&#39;axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imagerie 3-D et de l&#39;analyse des neurones infecté<em&gt; In Vivo</em&gt; Avec<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...