Ce matériau est basé sur des travaux appuyés par la Fondation nationale des sciences par la concession numéro 0842736.

Introduction à la nouvelle configuration GFS La SFP est constitué de plusieurs éléments essentiels: un microscope à lumière régulière, une monture équatoriale, une caméra et un ordinateur [Figure 1]. Les scellés de flux des cellules de chambre qui détient l&#39;échantillon est également indispensable en fonction de la conception des SFP. Le microscope optique est monté sur la monture équatoriale de sorte que le champ peut être tourné dans différentes orientations dans l&#39;espace. Cette capacité permet au vecteur statique de la gravité pour être exploitées de telle sorte que les échantillons peuvent être dynamiquement orienté par rapport au vecteur ainsi la force de gravité peut conférer des charges vigueur piconewton-gamme pour les échantillons. La caméra remplace la lentille oculaire du microscope optique afin qu&#39;il puisse enregistrer des changements dans l&#39;orientation de l&#39;échantillon. Ces données brutes sont numérisées et manipulée par l&#39;ordinateur pour interpréter les données en vigueur réelle et les mesures de distance. Les scellés de débit chambre est conçue pour permettre à tous les degrés de liberté dans l&#39;espace sans perte d&#39;échantillon. Dans la chambre se trouve la molécule de l&#39;échantillon, qui est attaché près d&#39;une extrémité à une &quot;ancré&quot; perle qui est collé à la surface de la chambre. Le terminus opposé est attaché à un &quot;mobile&quot; perle qui est libre de la surface de la chambre. C&#39;est ce mobile perle, libre dans le tampon d&#39;analyse qui peuvent être appliquées par la force gravitationnelle en sondant la molécule attachés à des charges de faible force [Figure 2]. L&#39;échantillon ressemble simplement à une paire de microsphères sous le microscope, mais il ne prend une certaine expérience de discerner le bien utilisable paires couplées par leur attachement à une molécule à partir de couples où les deux perles sont assis sur la surface de l&#39;écoulement de chambre. Une modification du système est l&#39;ajout d&#39;une plate-forme flottante qui détient le GFS et est suspendu par des ressorts. Dans cette configuration, une fois l&#39;échantillon a été tourné dans une position où la force gravitationnelle peut agir sur l&#39;échantillon, la plate-forme et toutes ses composantes peuvent être déposés contre la constante du ressort. Près de la chute libre, la force agissant sur le talon mobile est proche de zéro et à l&#39;extension maximale des ressorts, la force gravitationnelle est multiplié par autant que deux fois. De cette façon, un gradué de force / distance de la réponse peuvent être représentées graphiquement afin de mesurer le comportement d&#39;une molécule unique à des charges différentes vigueur. 1. Préparation de microsphères <ol><li> Immergez environ 10 mg de billes de verre ou de silice dans 0,04% de 3-aminopropyltriéthoxysilane (coupé avec de l&#39;acétone) pour deux minutes. </li><li> Rincer avec deux changements d&#39;eau bidistillée et centrifuger pour sédimenter à 2000 xg pendant 5 minutes. Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon de couplage (0,01 M pyridine coupé avec de l&#39;eau doublement distillée et ajuster le pH à 6,0), et agiter ce mélange vigoureusement. Centrifuger comme décrit ci-dessus. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Pour le gâteau humide de perles, ajouter 2 mL de la solution glutaraldéhyde à 5% (coupé glutaraldéhyde avec le tampon de couplage). Agiter vigoureusement. </li><li> Sous une hotte, tourner talon mélange / glutaraldéhyde pendant 3 heures à température ambiante. </li><li> Centrifuger comme ci-dessus et aspirer le surnageant. </li><li> Laver les billes dans 5 ml de tampon de couplage, en les secouant vigoureusement et centrifuger et aspirer le surnageant. Répétez ceci trois fois. </li><li> Ajoutez environ 15 pi de l&#39;anticorps désiré à des billes et agiter vigoureusement. Les perles devrait être tourné pendant 16-24 heures. </li><li> Sous le capot, ajoutez 5 ml de solution 1 M trempe glycine (glycine coupé à l&#39;eau distillée double et ajuster le pH à 7,0). Agiter vigoureusement le mélange et faire tourner pendant 30 minutes. </li><li> Centrifugeuse et aspirer le surnageant. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon de lavage (0,01 M Tris, pH 7,0; azide de sodium 0,1%, 0,1% de BSA; 0,15 M de NaCl et 0,001 M EDTA). Agiter vigoureusement ce, centrifugeuse et aspirer le surnageant. Répétez cette étape trois fois supplémentaires. </li><li> Changer de tampon à faible teneur en sel du tampon (0,1 M de KCl, 0,02 M d&#39;imidazole; MgCl2 5 mM, ajuster le pH à 7,0). Répétez trois fois. </li></ol> 2. Pièce jointe échantillon à des microsphères <ol><li> Prenez une petite quantité de billes préparées (environ 2 pi de chaque gâteau de perles cependant, si il ya un grand écart de diamètre entre les lots, il est avantageux d&#39;utiliser un ratio autour de 08:01 du grand pour de petites perles) et les ajouter à un microtube avec le tampon de dosage. Réduire la concentration de votre protéine d&#39;environ 5 uM, en utilisant le tampon de dosage. Préparer au moins un volume total de 400 ul, y compris le tampon, les protéines et les perles. </li><li> Tournez ce mélange à environ 1 RPM pour 3 heures (si la protéine est trop agitée, elle sera totale et deviennent inutiles). </li></ol> 3. Préparation Chambre Glissez <ol><li> Manteau une lame de microscope d&#39;épaisseur avec de la nitrocellulose 0,01% (dans l&#39;acétate d&#39;amyle). Laissez cette diapositive à sec pendant environ 10 minutes. </li><li> Avec un coupe-verre tranchant, couper couvercle coulissant de manière à faire une chambre. Cela nécessite quatre bandes de verre. </li><li> Utilisez le faitORY bord du verre et râteau c&#39;est à travers un frottis de graisse à vide des deux côtés de la bordure. </li><li> Bandes de graisse presse enduit sur nitrocellulose séchée couvertes glisser pour créer une boîte sur la surface de la lame. </li><li> Pipeter environ 2 ul de mélange billes / protéine en tapant sur pipetteur surface du verre intérieur de la boîte. </li><li> Ajouter environ 20 à 400 ul de tampon faible teneur en sel selon la taille de la chambre est. </li><li> Appuyez sur une lamelle sur le dessus de la boîte qui est déjà enduite de graisse à vide pour terminer la chambre étanche et tamponné. </li><li> Laissez glisser assis sur un plateau de sorte que le perles ont largement le temps de s&#39;ancrer à la nitrocellulose. </li></ol> 4. GFS Acquisition de données <ol><li> Glisser sur le mont GFS étape </li><li> Surveiller ce que l&#39;appareil d&#39;enregistrement et de GFS est légitime de rechercher des &quot;paires perles», dans lequel la microsphère petite est fixé près de l&#39;équateur de la microsphère grande. </li><li> Quand une paire est trouvée potentiels perles, passer par la profondeur de champ afin de déterminer si les &quot;mobiles&quot; perle ne se repose pas sur la surface de la lame. </li><li> Une fois une paire appropriée est identifiée, noter l&#39;angle mobiles perle est loin de d max (d max = la distance maximale entre les centroïdes des microsphères couplées). Déplacer le champ en position d&#39;acquérir la vidéo. </li><li> L&#39;angle de déplacement de la SFP devraient être suffisants pour enregistrer d min, d max, min et D qui pourrait appeler des 25-90 degrés en fonction de la longueur de la molécule. </li><li> RECORD que la paire se déplace de d min à d max et revenir à d min. </li><li> C&#39;est une bonne idée aussi de tourner un film sur le fond de sorte qu&#39;il peut être soustraite tard pour analyse. </li><li> Si vous effectuez une baisse GFS, déplacez le champ Retour à d max et d&#39;enregistrer la baisse à au moins 60 images par seconde. La partie critique est la première oscillation, mais un temps record à long peut aussi être utilisé pour l&#39;étude dynamique. </li></ol> 5. GFS Data Analysis <ol><li> Transformez la vidéo brutes en numérique &quot;seuillée&quot; l&#39;image et exécuter des macros dans ImageJ pour déterminer la position centroïde de chaque bille dans chaque image de la vidéo. C&#39;est aussi pour la vidéo-déposer. </li><li> Dump de l&#39;X, Y et données de la zone d&#39;ImageJ dans Excel et tracer les points. </li><li> Si une paire correcte perle a été acquis par la vidéo, une bosse visible dans le graphique est révélatrice des perles étant au plus proche de leur (d min) et à l&#39;apex de la courbe est la position de d max. </li><li> Grâce à ces données, le rayon de chaque bille doit être déterminée précisément dans ImageJ et toutes ces informations sont mises dans l&#39;équation imbriquées: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0.5 g = [D + R 2 min b 2 - (R a + r b) 2] = 0,5 R β sin b C = D max - R a - g (D = distance entre centroïdes, g = force de gravité; α = l&#39;angle en degrés parallèles à l&#39;objectif; r b = rayon de la téléphonie mobile bourrelet; r = rayon de une ancré bourrelet; β = angle de l&#39;attachement hors de l&#39;axe de l&#39;équateur de l&#39;ancrage de perles. </li><li> En utilisant le rayon équipé du mobile bourrelet qui donne aussi son volume, et étant donné la densité de la bille, la force de la perle mobiles confère à la molécule peut être calculé de piconewtons après la flottabilité du solvant est soustraite. Cette méthode mesure la force sur la molécule attaché dans piconewtons et calcule la longueur molécule absolue entre les pièces jointes d&#39;anticorps en nanomètres. F = V (db) a (F = force, V = volume, d = densité de la microsphère de verre, une accélération = due à la pesanteur, b = la densité de l&#39;eau déplacée). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Si la préparation des billes est fait correctement, il y aura moins d&#39;agrégation perles bien qu&#39;il y ait peut-être encore une motte occasionnels perle. Lorsqu&#39;on regarde à travers le champ, il devrait y avoir une répartition raisonnable de perles si jumelé ou non dans la chambre. Il est important de minimiser les vibrations, autant que possible, pour cela soit une table de l&#39;air, aux chocs spéciale absorbant les pieds d&#39;un trépied qui détient une monture EQ, ou sur le système qui utilise des ressorts peuvent être utilisés pour l&#39;isolation des vibrations. Une autre astuce utile sur la chambre de circulation étanche est de la laisser reposer pendant environ cinq minutes sur une table de niveau après qu&#39;elle a été entièrement construite. Cela permet à toutes les billes seules grandes flotter à travers le tampon et le repos dans la couche de nitrocellulose. Si la lame ont été montées à la place directement à la fin, l&#39;enquêteur serait continuellement avoir à traiter avec des perles littéralement voler à travers le champ de vision, et si cela se produit lors de l&#39;acquisition vidéo, il peut corrompre èmeexpérimentation électronique. Si cela est fait correctement, le vol est considérablement minimisé perles et des résultats vidéo plus propre. Quand une paire potentiels perle est identifié par l&#39;opérateur GFS, il est utile de le mettre dans une rotation préliminaire pour surveiller le comportement de la paire. Rarement, la grosse perle n&#39;est pas solidement fixée à la diapositive. Si cela arrive, il est inutile dans l&#39;utilisation de la paire, car il est essentiel que le plus grand ancré séjour perles dans une position fixe pendant toute la durée de l&#39;acquisition. Si le couple est stable et ne présente pas «ancré rouleau perles», puis il est adapté à l&#39;expérimentation. Une parcelle de distances de séparation billes par rapport au changement de l&#39;angle par rapport à la gravité peut être utilisé pour évaluer les données acquises. Un résultat bon représentant montrerait guère de séparation sur un plateau et que le cordon de mobiles se libère de la perle ancré raison de l&#39;influence de la gravité, le graphique montrera plus de séparation. Cela continue jusqu&#39;à un pic de Nice est atteint ce qui est appelé d max et la courbe commence à la baisse à nouveau retourner à la base d min [Figure 1]. Dans des conditions idéales, cette signature est symétrique. Un résultat non représentatif serait afficher un graphique avec des motifs incohérents ne montrant aucun distinctes d min-max d-d pattern min, ou elle montrerait les séparations qui sont des ordres de grandeur trop élevé pour une seule molécule indiquant peut-être il y avait un morceau de poussière entre les perles, ou peut-être que le talon du mobile a été tout simplement pas attachés du tout. Le processus de trouver la paire, c&#39;est le tir, c&#39;est le traitement, et il analyse les lacunes a cesser de nombreux cas où incorrecte paires perles sont abattues sur. Donc, si vous arrivez à la fin du processus dans son ensemble et vous avez une longueur molécule qui est conforme aux résultats précédents, on peut être très confiants que la paire originale perle est représentatif et peut être inclus dans les résultats. Dans un bon jour, environ la moitié de la prise de perles paires peuvent être prises par le biais de devenir un point légitimes des données. Par exemple, la longueur de la bobine enroulée de la myosine entre les MF20 MF30 et les anticorps, est connue basée sur les données EM et de l&#39;AFM, les données à l&#39;approche de 100 nm 2,7,8,9. Si le résultat est plusieurs fois cette longueur, l&#39;échantillon a agrégées. Les résultats présentés ici sont tirées des expériences standard de rotation GFS et démontrer une distance de 96 nm ± 5 nm, [Figure 2], qui accepte en étroite collaboration avec les mesures de la MF30 (qui se lie à l&#39;extrémité N-terminale de la myosine sous-fragment-2) et MF20 (qui se lie dans le meromyosin lumière) la distance de séparation d&#39;anticorps sur la myosine déduite des valeurs littérature [Figure 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Configuration de GFS. De grandes parties de GFS sont étiquetés. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma de principe GFS. Le côté gauche montre centroïde de la téléphonie mobile perle à une distance minimale de centroïde de billes ancrées. Comme GFS est tournée, mobiles perles aligne avec le vecteur de gravité qui est aussi parallèle à l&#39;axe de la molécule attachés. Dans cette position, la distance entre les centroïdes des perles mobiles et ancrés est à son maximum. En haut à droite montre une tranche représentative d&#39;un film de GFS. En bas à droite est une image de la rotation GFS subir. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3 résultat représentatif montrant min D sur la gauche du graphique;. D max à une séparation relative de 17,78 microns et un retour à la vitamine D dans la ligne de base d&#39;environ 17,75 microns de séparation relative entre les billes. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Résultat représentatif de l&#39;expérience de rotation GFS montrant la distance entre MF20 MF30 et anticorps en moyenne 96 nm. Cela représente la durée approximative de S2. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Myosine II dimère utilisé pour afficher les pièces jointes possibles pour une utilisation avec le GFS, y compris d&#39;anticorps et / ou les pièces jointes d&#39;actine. Différentes possibilités de fixation permet de différentes stratégies de GFS pour mesurer les différentes régions, ou pour demander force perpendiculaire ou parallèle à la tige de domaine du dimère de myosine.

<ol>
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Lors de la conversion d&#39;un film à une représentation numérique seuillée, il est crucial pour l&#39;image seuillée pour maintenir la même région, dans chaque image de la vidéo. Parce que les perles dans une paire de billes se déplacent indépendamment les uns des autres, toute dérive dans les zones seuillée peuvent aussi causer les distances relatives entre les centroïdes des perles à la dérive et d&#39;introduire des erreurs significatives. Contrôle de la zone seuil réduit l&#39;erreur de cinq fois d...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

L&#39;étude de la structure macromoléculaire est devenue critique à l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires et de la fonction. Il ya plusieurs BioInstruments limité, mais important, capable de tester la dépendance vigueur de caractéristiques structurelles de protéines. Échelle a été un paramètre limitant de la précision avec les chercheurs peuvent les pairs dans le monde nanomécaniques de molécules, comme les acides nucléiques, enzymes et protéines motrices qui assurent maintien de la vie de travail. La microscopie à force atomique (AFM) est bien réglé pour déterminer les structures des protéines fibreuses natif avec une résolution de distance à égalité avec la microscopie électronique. Toutefois, dans les études de la force AFM, les forces sont généralement beaucoup plus élevé que une seule molécule pourrait l&#39;expérience 1, 2. Pièges optiques (OT) sont très bons à la détermination de la distance relative entre les billes piégées et qu&#39;elles peuvent transmettre des forces très petit 3. Cependant, ils ne donnent pas de précision longueurs absolues des molécules à l&#39;étude. Simulations moléculaires fournissent des informations favorables à de telles expériences, mais ils sont limités dans la capacité à gérer les mêmes grandes tailles moléculaires, de longues périodes, et convaincre certains chercheurs en l&#39;absence de preuves à l&#39;appui d&#39;autres 2, 4. La force gravitationnelle spectromètre (SFG) remplit un créneau essentiel dans l&#39;arsenal d&#39;un enquêteur en offrant une combinaison unique de capacités. Cet instrument est capable de générer des forces en général, avec 98% ou plus de précision de la gamme à la gamme femtonewton nanonewton. Les mesures de distance sont actuellement capables de résoudre la longueur moléculaire absolue à cinq nanomètres, et relative perles distances de séparation paire avec une précision semblable à un piège optique. En outre, le SFP peut déterminer étirement ou dévidage où la force est à proximité de l&#39;équilibre, ou de fournir une force graduée de juxtaposer contre toute modification structurelle mesurée. Il est même possible de déterminer combien de résidus d&#39;acides aminés sont impliqués dans des événements dérouler sous une force physiologique 2. Contrairement à d&#39;autres méthodes où il ya l&#39;étalonnage vigueur vaste qui doit précéder toute épreuve, le SFP nécessite pas de calibration telle force 5. En complétant les forces d&#39;autres méthodes, le GFS combler les lacunes dans la compréhension de la nanomécanique de protéines essentielles et d&#39;autres macromolécules.

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Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Ceci est une étape-par étape indiquant l&#39;objet, l&#39;exploitation et des résultats représentatifs du spectromètre force gravitationnelle roman.

Démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de s&#39;étirer et de mesurer les protéines fibreuses

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K vues.  University of North Texas. Ceci est une étape-par étape indiquant l'objet, l'exploitation et des résultats représentatifs du spectromètre force gravitationnelle roman.

Vidéo: Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Croissance stretch Axon: La mécanotransduction de croissance neuronale

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Recherche

Bio-ingénierie

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ à la compression de chargement et d&#39;imagerie non invasive corrélative de l&#39;os-ligament parodontal-dent Fort commune

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Dosage enzymatique pour mesurer l&#39;inhibition de transcription par le gallium (III) et H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d&#39;une monocouche de phospholipides

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

High Speed ​​Sous-GHz spectromètre pour Brillouin Scattering Analyse

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...