The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.

1. Instructions générales <ol><li> aziridine de magasin cofacteur 6BAz (dans du DMSO) et de la protéine MTase Set7 / 9 à -80 ° C et tous les autres réactifs, y compris cofacteur double-activé et SeAdoYn ADN MTase M.BseCI (dans 50% de glycerol) à -20 ° C. </li><li> Déterminer la concentration de 6BAz et SeAdoYn par spectroscopie UV / VIS à l&#39;aide de 269nm (6BAz) = 16,000 cm -1 M -1 et ε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 cm -1 M de coefficients d&#39;extinction -1 dans l&#39;eau déminéralisée. Déterminer la concentration de MTases par le dosage de Bradford ou, si le coefficient d&#39;extinction est disponible, par absorption directe à 280 nm. </li><li> Essayez d&#39;éviter de créer des bulles par la pipette ou vortex intensive pour éviter la perte de l&#39;activité enzymatique. Au lieu de cela, mélanger en pipetant doucement monter et descendre. </li><li> Lors de l&#39;ajout de cofacteurs aziridine partir de solutions mères dans du DMSO se assurer que la concentration finale de DMSO dans le dosage est moinsà 5%. Toujours inclure des ions de magnésium 10 mM dans le tampon d&#39;essai pour empêcher des réactions non spécifiques avec l&#39;ADN. </li><li> Lors de l&#39;ajout doubles cofacteurs activés partir de solutions mères acides utiliser de petits volumes (solutions mères très concentrés) pour éviter les changements de pH et de se assurer que le pH de la solution de dosage ne change pas de façon significative. Eviter les thiols, par exemple, β-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (DTT), dans le tampon de dosage, car ils peuvent interférer avec la réaction clic par complexation des ions de cuivre est requise. </li></ol> 2. Une étape marquage de l&#39;ADN via AZIRIDINE cofacteurs <ol><li> Methyltransferase induite label ING spécifiques de séquence (Sourire) de l&#39;ADN plasmidique avec M.BseCI ADN MTase et aziridine cofacteur 6BAz. <ol><li> Décongeler la solution de cofacteurs à 20 ° C et préparer les mélanges réactionnels sur de la glace. </li><li> En plus du dosage effectuer un contrôle &quot;cofacteur&quot;, pour visualiser les modifications non spécifiques, et un &amp; #8220; enzyme &quot;le contrôle, pour se assurer que la préparation MTase est libre de la AdoMet cofacteur naturel. </li><li> Pour le dosage mélange 2 pi de 10 x tampon de modification (contenant 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl2, 20 mM de β-mercaptoéthanol, pH 7,4), 2 ul de pBR322 (0,5 ug / ul), 10 éq. M.BseCI par séquence de reconnaissance sur l&#39;ADN (séquence de reconnaissance dans une pBR322) et le cofacteur aziridine 6BAz à une concentration finale de 60 uM dans un volume total de 20 ul. Ajouter cofacteur et l&#39;ADN MTase dernière. REMARQUE: β-mercaptoéthanol est toxique, corrosif et dommageables pour l&#39;environnement. </li><li> Pour le contrôle &quot;cofacteur&quot; ajouter de l&#39;eau déminéralisée à la place de M.BseCI et pour le contrôle &quot;de l&#39;enzyme&quot; ajouter de l&#39;eau déminéralisée à la place de 6BAz. </li><li> Mélanger les solutions en pipetant doucement monter et descendre. </li><li> Incuber les tubes à 55 ° C pendant 1 heure. </li><li> Centrifuger brièvement pour collecter tout liquide au fond des tubes. </li></ol></li><li> Test de restriction-modification de vérifier modification de l&#39;ADN. <ol><li> Préparer une solution en mélangeant 10 pi de tampon 10x R.TaqI (contenant 100 mM de Tris-HCl, 50 mM de MgCl2, 1 M de NaCl, 1 mg / ml d&#39;albumine de sérum bovin, pH 8,0), 80 pi d&#39;eau désionisée et 3,3 ul de la endonucléase de restriction (Rease) à partir de Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / pl). Assurez-vous d&#39;ajouter le Rease dans la dernière étape. </li><li> A chaque tube de 2.1.7 ajouter 2 ul de tampon 10X Taq I et R. 28 ul de la solution ci-dessus à partir de (2.2.1). </li><li> Mélanger les solutions en pipetant doucement monter et descendre. </li><li> Incuber les tubes à 65 ° C pendant 30 min. </li><li> Centrifuger brièvement pour collecter tout liquide au fond des tubes. </li></ol></li><li> Électromobilité dosage de décalage (EMSA) avec de la streptavidine pour vérifier modification fonctionnelle. <ol><li> Retirer 25 pi de chaque tube (2.2.5) et ajouter 2,4 ul d&#39;une solution de streptavidine (1 mM par rapport à la streptavidine monomer dans un tampon de streptavidine contenant 100 mM de Na 2 HPO 4, NaCl 100 mM, pH 7,5; 4 équivalents de biotine total). Ajouter 2,4 pi de tampon de streptavidine dans les tubes restants. </li><li> Incuber tous les tubes à 37 ° C pendant 1 heure. </li></ol></li><li> L&#39;analyse par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. <ol><li> Ajouter 5 ul de tampon 6x de chargement (0,25% de bleu de bromophénol, 30% de glycerol) à chaque tube. </li><li> Mélanger délicatement les solutions. </li><li> Charge 10 pi de chaque échantillon dans les puits d&#39;un gel d&#39;agarose (1% d&#39;agarose dans un tampon 0,5x TBE contient 1x GelRed partir d&#39;une solution 10.000 fois de stock). </li><li> Exécutez le gel dans du tampon TBE 0,5x avec 80 V env. 1 h. </li><li> Visualiser les bandes d&#39;ADN sur une table UV (312 nm) avec une caméra CCD équipé d&#39;un filtre (540 ± 50 nm). REMARQUE: la lumière UV est dommageable pour les yeux et la peau. </li></ol></li></ol> 3. Deux étapes Protein Labeling via cofacteurs Double Activé <ol><li> MethyltransfTransfert de groupes activés (MTAG) avec Set7 / 9 et le cofacteur double-SeAdoYn activé pour histone H3 lysine 4 étiquetage (étape de modification) l&#39;effacement Réalisé. <ol><li> Décongeler les composants et préparer les mélanges de réaction sur de la glace. REMARQUE: Toujours garder SeAdoYn refroidi pour éviter la dégradation. </li><li> En plus du dosage effectuer un contrôle &quot;cofacteur&quot;, pour visualiser les modifications non spécifiques, et une commande &quot;enzyme&quot;, d&#39;exclure les réactions non-spécifiques de la sonde fluorescente. </li><li> Préparer une solution d&#39;essai (20 ul) contenant du tampon de modification (50 mM Tris-HCl, 5% de glycerol, pH 8,5), 10 uM d&#39;histone H3, 10 uM Set7 / 9 et 600 uM SeAdoYn (mélange des deux épimères en sélénium). Dans les dernières étapes ajouter cofacteur puis MTase. </li><li> Pour le contrôle &quot;cofacteur&quot; préparer une solution de dosage en 3.1.3 et ajouter 60 mM AdoMet de rivaliser avec le cofacteur synthétique. Pour le contrôle &quot;de l&#39;enzyme&quot; ajouter de l&#39;eau déminéralisée à la place de SeAdoYn.</li><li> Mélanger les solutions en pipettant doucement de haut en bas. Vérifier le pH en ajoutant 1 ul de chaque solution dans le domaine supérieur d&#39;une bande de pH (plage de pH 5-10). </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> En attendant, le gel préparer un gel à 12% de polyacrylamide-SDS (course: Bis-Tris 357 mM, pH 6.5 à 6.8, 0,1% (p / v) APS, 0,04% (v / v) de TEMED et 12% d&#39;acrylamide / bisacrylamide 37,5: 1 ; gel de chargement: 357 mM de Bis-Tris, pH 6.5 à 6.8, 0,1% (p / v) APS, 0,04% (v / v) de TEMED et 5% d&#39;acrylamide / bisacrylamide 37,5: 1). NOTE: L&#39;acrylamide / bisacrylamide est toxique et dangereux pour la santé. Porter des gants lors de cette procédure. </li></ol></li><li> Marquage chimique de la lysine dans alkinylated 4 histone H3 par cycloaddition de l&#39;azide-alcyne (CuAAC) (étape de marquage) catalysée par le cuivre. <ol><li> Juste avant la fin de la réaction de modification préparer un clic 5x mélange contenant 3 mM de CuSO 4, 3 mM de tris (3-hydroxypropyl-triazolylméthyl) amine (THPTA), l&#39;ascorbate de sodium 250 mM et 6 mM d&#39;azide avec un TAMRAvolume total de 20 ul. </li><li> Ajouter 5 ul de la 5x clic mélange fraîchement préparé dans chaque tube pour démarrer le CuAAC et éteindre la réaction de modification. </li><li> Mélanger doucement en pipetant. </li><li> Protéger tous les tubes avec une feuille d&#39;aluminium de la lumière pour éviter photo-blanchiment du fluorophore. </li><li> Incuber à 20 ° C pendant 1 heure. </li></ol></li><li> La précipitation des protéines pour enlever l&#39;excès de la libre fluorophore TAMRA. <ol><li> Pour éviter resplendissement de l&#39;histone H3 marqué fluorescent par intensive fluorescence dans-gel de la libre fluorophore TAMRA, enlever l&#39;excès de fluorophore par précipitation des protéines (3.3.2 - 3.3.4) 34. </li><li> Ajouter 75 ul méthanol, 18,8 pi chloroforme et 50 pi d&#39;eau déminéralisée à chaque tube et vortex brièvement après chaque addition. Centrifuger à 16 000 g pendant 5 min. Retirer la phase supérieure sans perturber la couche d&#39;interface, qui contient la protéine. </li><li> Ajouter 56,3 pi méthanol à la phase restante in chaque tube vortex et centrifuger à 16 000 xg pendant 5 min pour sédimenter les protéines. Eliminer le surnageant. Répétez cette étape pour laver le culot. </li><li> Couvrir les tubes ouverts avec un tissu non pelucheux et laissez-les sécher pendant 15 à 30 min. </li></ol></li><li> Analyse par SDS PAGE. <ol><li> Dissoudre les protéines précipitées du 3.3.4 dans 20 ul de tampon de charge SDS (50 mM de Tris-HCl, 2,5% (p / v) de SDS, 10% (v / v) de glycerol, 320 mM de β-mercaptoéthanol et 0,05% (p / v) de bleu de bromophénol, pH 6,8). Assurez-vous de dissoudre complètement la pastille en rinçant les parois des tubes avec une pipette. </li><li> Incuber les échantillons à 95 ° C pendant 10 min et laisser refroidir à 20 ° C. </li><li> Centrifuger brièvement pour collecter tout liquide au fond des tubes. </li><li> Charger la totalité du montant de chaque échantillon dans les puits d&#39;un gel de polyacrylamide SDS (3.1.7). Utiliser 50 mM MOPS, 50 mM de Tris-X (Tris-base), EDTA 5 mM, 0,1% (p / v) de SDS comme tampon pour électrophorèse. </li><li>Exécutez le gel avec 120 V pendant env. 90 min. </li><li> Visualiser la fluorescence dans le gel sur une table UV (312 nm) avec une caméra CCD équipé d&#39;un filtre (540 nm ± 50 nm). REMARQUE: la lumière UV est dommageable pour les yeux et la peau. </li></ol></li></ol>

The authors disclose the following competing financial interest: E.W. is inventor on related patents.

Étiquetage en une seule étape de l&#39;ADN avec MTases d&#39;ADN et des cofacteurs d&#39;aziridine (ADN Sourire) est une méthode robuste mais certains aspects doivent être considérés lors de la planification de l&#39;expérience. Cofacteur aziridine: La concentration 6BAz pour l&#39;étiquetage d&#39;ADN avec M.BseCI était de 60 uM. Lors de l&#39;utilisation d&#39;autres MTases ADN la concentration de cofacteur doit être optimisée, par exemple des concentrations au...

Étiquetage spécifique d&#39;acides nucléiques et de protéines 1,2 3,4 est d&#39;un intérêt majeur pour les caractérisations fonctionnelles, le diagnostic médical et (nano) la biotechnologie. Nous présentons ici une méthode de marquage enzymatique pour ces biopolymères qui est basé sur S -adenosyl-L-méthionine (SAM ou AdoMet) méthyltransférases dépendantes (de MTases). Cette classe d&#39;enzymes (EC 2.1.1.) Cible nucléophiles positions individuelles (azote, d&#39;oxygène, de soufre et des atomes de carbone) à l&#39;intérieur des résidus spécifiques d&#39;acides nucléiques et de protéines et transfère le groupe méthyle activé de l&#39;AdoMet cofacteur (figure 1A) 5 naturellement. En outre, MTases peuvent utiliser des analogues synthétiques de cofacteurs pour un étiquetage spécifique avec des étiquettes d&#39;affinité, des fluorophores ou d&#39;autres étiquettes (figure 1B) 6. Deux classes d&#39;analogues AdoMet ont été développés: cofacteurs aziridine pour S equence spécifique M ethyltransferase- I </strong&gt; Nduced L abel ING (Sourire) 7 et doubles analogues AdoMet activés pour m ethyltransferase dirigée de Transfert d&#39;un G roupes ctivated (MTAG) 8. <img alt="Figure 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1: Réactions catalysées par des méthyltransférases (MTases) de transfert de groupe A. méthyle à partir du cofacteur naturel AdoMet (SAM) sur divers substrats, y compris l&#39;ADN, l&#39;ARN, les protéines et les petites biomolécules B. Identification / fonctionnalisation des acides nucléiques et des protéines (NNNNN =.. paires de bases de l&#39;ADN, des nucleotides de l&#39;ARN et des acides aminés pour les protéines; XXXXX = séquence de reconnaissance de la MTase résidu avec de cible en vert) avec des analogues de synthèse de cofacteurs. Cofacteurs aziridine contenant un groupe rapporteur (sphère bleue)fixé au noyau adenine sont séquence spécifique couplé avec le résidu cible (à gauche) et analogues doubles activé AdoMet conduit au transfert de chaînes alkyle étendues portant un reporter chimique Y (à droite) qui peut être marqué par bioorthogonal clic réaction dans une seconde étape. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Cofacteurs aziridine fonctionnent mieux avec des ADN MTases. Ils contiennent un cycle à trois à un atome d&#39;azote 9 (ou un N de moutarde 10,11) à la place du centre de sulfonium en tant que groupe réactif. La protonation de cet atome d&#39;azote active le cycle aziridine pour une attaque nucléophile par le nucléotide cible qui entraîne le couplage covalent de l&#39;ensemble avec de l&#39;ADN cofacteur. En attachant des groupes rapporteurs à l&#39;anneau de l&#39;adénine les cofacteurs d&#39;aziridine peuvent être utilisés en combinaison avec de l&#39;ADN pour marquer MTases ADN en une étape ( <stron<html> g&gt; Figure 1B, de gauche) 7,12. Cela est démontré en détail pour la biotinylation de l&#39;ADN avec 6BAz 13-15 (cofacteur aziridine avec de la biotine attachée à la position 6 du cycle adénine) et l&#39;ADN spécifique à l&#39;adénine MTase de Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (Figure 2, voir la section 2 du protocole: étiquetage en une seule étape de l&#39;ADN via aziridine cofacteurs). En plus de M.BseCI («séquence de reconnaissance, l&#39;ADN MTases à partir de Thermus aquaticus (M.TaqI, 5&#39;-TCG A -3 5&#39;-ATCG Un T-3) &#39;), à partir de Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 »-G C GC-3 &#39;), et de Spiroplasma (M.SssI, 5&#39;-C G-3&#39;) ont été utilisés avec succès pour biotinyler ADN avec 6BAz 17. En outre, des cofacteurs aziridine peuvent être utilisés pour une étape de marquage d&#39;ADN par fluorescence 18,19. ontenu &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2:. Séquence spécifique à une étape de biotinylation avec M.BseCI ADN et l&#39;ADN MTase 6BAz M.BseCI reconnaît la séquence d&#39;ADN double brin 5&#39;-ATCG A T-3 &#39;et méthylation du groupe amino de la seconde adénine naturellement résidu (vert) en utilisant AdoMet. Avec le cofacteur aziridine 6BAz le cours de la réaction est changé et M.BseCI conduit à séquencer biotinylation spécifique d&#39;ADN en couplant l&#39;ensemble cofacteur y compris biotine (bleu) avec l&#39;adénine cible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Double analogues activés AdoMet contient étendues de chaînes latérales insaturées au lieu d&#39;un groupe méthyle au centre de sulfonium (figure 1B </strong&gt;, droite) 20. Le double ou triple liaison insaturée dans β-position pour le centre de sulfonium compense électroniquement effets stériques défavorables au sein de l&#39;état de transition par la stabilisation de conjugaison. Étant donné que le centre de sulfonium et activent la liaison insaturée de la chaîne latérale pour le transfert enzymatique, ces co-facteurs ont été nommés analogues AdoMet double-activées. Typiquement, ils sont utilisés pour transférer des chaînes latérales avec des groupes uniques chimiques (reporters chimiques), comme les groupes amino, alcyne et azoture, par chimio-sélective étiquetage dans une deuxième étape 8,21. En général, les analogues doubles activé AdoMet peut non seulement fonctionner comme cofacteurs pour l&#39;ADN MTases 8,20,21 mais aussi pour l&#39;ARN MTases 22,23 et MTases de protéines de 24 à 28 permettant étiquetage supplémentaire de l&#39;ARN et des protéines. Cependant, les longues chaînes latérales sont stériquement plus exigeant que un groupe méthyle et en élargissant les sites actifs MTASE par ingénierie des protéines est souventfr nécessaire pour obtenir des taux de transfert efficaces. Une autre solution à ce problème est d&#39;utiliser un analogue AdoMet avec un petit groupe de propargyle (trois carbones) où l&#39;alcyne terminale sert deux fonctions: 1. La stabilisation de l&#39;état de transition pendant le transfert enzymatique et 2. poignée réactif pour la suite de modifications chimiques de cuivre catalysée cycloaddition azoture-alcyne (CuAAC) click chemistry. Il se est avéré que le propargylique résultant AdoMet analogique 29 est assez instable dans des conditions neutres ou légèrement basiques et seulement d&#39;une utilité limitée. Cet inconvénient peut être résolu en remplaçant l&#39;atome de soufre par le sélénium. Le cofacteur résultant 5 &#39;- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxypropyle] prop-2-ynylselenonio] -5&#39;-désoxyadénosine (SeAdoYn, figure 3) est acceptée par l&#39;ADN de type sauvage, l&#39;ARN MTases et de protéines de 30 à 32 qui abroge la nécessité d&#39;ingénierie des protéines dans de nombreux cas. Ceci est illustré par fluorescence pro<html> étiquetage protéine avec l&#39;histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Figure 3, voir la section de protocole 3: Deux étapes étiquetage de protéine via doubles cofacteurs activés). <img alt="Figure 3" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig3highres.jpg" width="700" /> Figure 3:. Spécifique de séquence à deux étapes marquage par fluorescence de l&#39;histone H3 avec Set7 / 9, SeAdoYn et TAMRA azide La protéine MTase Set7 / 9 méthylation naturellement le groupe amino de la lysine 4 de l&#39;histone H3 (H3K4, vert) à l&#39;aide AdoMet. Avec le cofacteur double-activé SeAdoYn l&#39;MTase transfère un petit groupe propargyle (rouge) au résidu de lysine. Le triple liaison terminal connecté est alors modifiée sélectivement en un clic réaction bioorthogonal (cuivre-catalysée azoture-alcyne cycloaddition, CuAAC) avec l&#39;azoture-dérivé TAMRA (tétraméthylrhodamine, bleu) fluorophore.charge / 52014 / 52014fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">6BAz</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10304980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Bis-Tris</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Boric acid</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Bromophenol blue Na salt</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right">15375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:139px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Chloroform</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right">10020090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">GelRed (10000x in water)</td>
			<td style="width:139px;">Biotium</td>
			<td align="right" style="width:119px;">41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Glycerol (99.5%)</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">FastRuler Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Histone H3</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">M.BseCI</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Methanol</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10675112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Magnesiumchloride&#160; hexahydrate</td>
			<td style="width:139px;">J.T. Baker</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">MOPS</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">pH strip (Neutralit)</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1,095,330,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">pBR322</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SD0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">R.TaqI (10u/&#181;l)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td>ER0671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">SeAdoYn</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Set7/9</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">SDS Granular</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">di-Sodiumhydrogenphosphat</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TAMRA-azide</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TaqI buffer (10x)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:245px;">N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:139px;">Acros Organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">42058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Tris-X (TRIS-base)</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific labeling of nucleic acids and proteins with methyltransferases and cofactor analogues

-Adenosyl S-L-méthionine (SAM ou AdoMet) méthyltransférases dépendantes (MTAse) catalysent le transfert du groupe méthyle de l&#39;AdoMet activé à des positions spécifiques dans l&#39;ADN, l&#39;ARN, les protéines et les petites biomolécules. Cette réaction de méthylation naturel peut être étendue à une grande variété de réactions d&#39;alkylation utilisant des analogues de synthèse de cofacteurs. Remplacement du centre de sulfonium de AdoMet réactif avec un cycle aziridine conduit à des co-facteurs qui peuvent être couplés avec de l&#39;ADN par diverses MTases d&#39;ADN. Ces cofacteurs aziridine peuvent être équipés avec des groupes rapporteurs à différentes positions de la fraction de l&#39;adénine et utilisés pour S spécifique M equence ethyltransferase- je nduced L abel ING de l&#39;ADN (DNA Sourire). Comme exemple typique, nous donnons un protocole de biotinylation de l&#39;ADN de plasmide pBR322 à la séquence 5&#39;-ATCG A T-3 &#39;avec l&#39;ADN MTase M.BseCI et le cofacteur aziridine dans 6BAzune étape. Extension du groupe méthyle activé avec insaturés groupes alkyle résultats dans une autre classe d&#39;analogues AdoMet qui sont utilisés pour m ethyltransferase dirigée de Transfert d&#39;un G roupes ctivated (MTAG). Étant donné que les chaînes latérales longues sont activés par le centre de sulfonium et de la liaison insaturée, ces co-facteurs sont appelés analogues AdoMet double-activées. Ces analogues, non seulement fonction de cofacteurs de l&#39;ADN, comme MTases les co-facteurs d&#39;aziridine, mais aussi pour un ARN, de protéines et de petites molécules. MTases Ils sont généralement utilisés pour la modification enzymatique de substrats MTAse uniques avec des groupes fonctionnels qui sont marqués avec des groupes rapporteurs dans une deuxième étape chimique. Ceci est illustré dans un protocole de marquage par fluorescence de la protéine histone H3. Un petit groupe propargyle est transférée du cofacteur SeAdoYn analogue à la protéine par l&#39;histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 suivie d&#39;étiquetage du clicalkynylated histone H3 avec TAMRA azoture. Étiquetage MTase médiation avec des analogues de cofacteur est une technologie habilitante pour de nombreuses applications intéressantes, dont l&#39;identification et l&#39;étude fonctionnelle des substrats MTASE ainsi que l&#39;ADN de génotypage et de détection de la méthylation.

Une étape marquage de l&#39;ADN via AZIRIDINE cofacteurs Cet exemple réaction est effectuée avec l&#39;ADN MTase M.BseCI, qui modifie le second résidu d&#39;adénine dans le A T-3 &#39;la séquence à double brin 5&#39;-ATCG et a un site de reconnaissance sur le plasmide pBR322 (figure 4A). Pour tester l&#39;étiquetage du plasmide pBR322 est contestée par l&#39;endonucléase de restriction (Rease) R.TaqI (5&#39;-TCGA-3 &#39;). R.TaqI possède ...

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Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

ADN et les protéines sont-séquence spécifiquement étiquetés avec une affinité ou groupes rapporteurs fluorescents à l&#39;aide ADN ou de protéines méthyltransférases et analogues de cofacteur synthétiques. En fonction de la spécificité du cofacteur des enzymes, aziridine ou doubles analogues de cofacteurs activés sont utilisés pour l&#39;étiquetage d&#39;une ou deux étapes.

Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

sequence-specific-labeling-nucleic-acids-proteins-with

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K vues.  RWTH Aachen University.  ADN et les protéines sont-séquence spécifiquement étiquetés avec une affinité ou groupes rapporteurs fluorescents à l'aide ADN ou de protéines méthyltransférases et analogues de cofacteur synthétiques. En fonction de la spécificité du cofacteur des enzymes, aziridine ou doubles analogues de cofacteurs activés sont utilisés pour l'étiquetage d'une ou deux étapes. 

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Détection d&#39;immunofluorescence Deux analogues de la thymidine (CldU et UDI) dans les tissus primaires

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

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Biologie

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / Flash d&#39;étiquetage et d&#39;analyse d&#39;images de protéines dans les cellules du capteur Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

Confirmation des voies métaboliques et la découverte par 13 C-étiquetage des acides aminés protéinogènes

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

D&#39;analyser et de structures d&#39;acides nucléiques avec 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...