Nous remercions les membres du laboratoire Meshorer, surtout Shai Melcer, Adi Alajem, Raghu Ram Edupuganti, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout et Alva Biran, pour les commentaires critiques et pour le dépannage des expériences de photoblanchiment sur une base quotidienne. EM est un H. Joseph et Belle R. Braun Senior Lecturer en Sciences de la Vie et est soutenu par la Fondation des sciences d&#39;Israël (ISF 943/09), le ministère israélien de la Santé (6007) de l&#39;Union européenne (IRG-206872 et 238176), l&#39;Israel Cancer Research Foundation, l&#39;interne Applicative Subventions de médecine de l&#39;Université hébraïque et de la psychobiologie Institut israélien.

1. Placage des cellules ES T = 0 h Plaquage MEF <ol><li> Manteau de l&#39;imagerie direct 8-même μ-Slides (ibidi; Munich, Allemagne) avec la gélatine ou dans des verres à couvercle chambrés (Lab-Tek; Rochester, NY) ou en boîtes de culture à fond de verre (MatTek; Ashland, MA). Départ pour 5-30 min et aspirer l&#39;écart de la gélatine sans. </li><li> Graine 22000 FAE / puits dans 250 ul volume total de DMEM [complété avec 10% sérum de veau fœtal (FBS)]. Permettent aux cellules de se développer dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% de CO2). </li></ol> T = 6 heures Placage de cellules ES <ol start="3"><li> Aspirer DMEM. </li><li> Graine de chaque MEF revêtement bien avec 15 000 cellules R1 / puits dans 250 ul du volume total des médias de cellules ES [complété avec 10% ESC-grade du sérum de veau fœtal (FBS), pyruvate de sodium 1 mM, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 0,1 mM β- mercaptoéthanol, et 1000 la leucémie facteur U / ml inhibitrice (FRV)], pour obtenir 30% à 50% de confluence le jour suivant. </li></ol> 2. Transfection des cellules ES T = 24 h. Transfection transitoire <ol><li> Remplacez le support de cellules ES avec 250 ul / puits de Fresh Media cellules ES. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml de test stérile, ajouter 100 ul de sérum médias libres [Opti-MEM (Gibco)], puis ajouter 10-Transit LT1 ul réactif de transfection (Mirus) directement dans les médias sans sérum. Mélanger doucement par pipetage et incuber à température ambiante pendant 5-20 min. </li><li> Ajouter 1,5 mg ADN de fusion GFP plasmide (H1E, H1o ou HP1) à l&#39;diluée transit LT1 réactif. Mélanger à la pipette doux et incuber à température ambiante pendant 15-30 min. </li><li> Ajouter 13,5 l / puits du mélange de transfection. Agiter le 8-même μ-Slides pour assurer une dispersion. Après 24 heures de remplacer les anciens médias de cellules ES avec 250 pi de Fresh Media cellules ES. </li></ol> 3. Exécution FRAP et FLIP T = 48-72 heures <ol><li> L&#39;expérience peut être effectuée sur un microscope confocal à balayage laser (CLSM) mais depuis une normale FRAP / FLIP expérience, de nombreuses images consécutives sont acquises, il est recommandé d&#39;utiliser un microscope confocal à disque rotatif, qui permet une vitesse d&#39;acquisition et assure que personne ne l&#39;échantillon indésirable blanchiment aura lieu après l&#39;événement initial de blanchiment intentionnel. Ici, nous vous recommandons d&#39;utiliser la Révolution filer disque système confocal (www.Andor.com), avec le Yokogawa CSU-X tête du disque en rotation. Ce système a la capacité dual photobleach utilisant un module spécialisé Frappa avec un système de points de numérisation et de rapidement passer la lumière en arrière pour recueillir des images en utilisant le disque en rotation. Les trois protéines fluorescentes les plus couramment utilisés pour les expériences de photoblanchiment sont GFP, YFP et Cherry. Si la GFP ou YFP sont utilisés, un laser ~ 488 nm est nécessaire. Pour Cherry, l&#39;utilisation d&#39;un laser ~ 560 nm. Dans tous les cas, nous recommandons d&#39;utiliser des lasers à semi-conducteurs. Ayant une étape automatisée est utile mais pas nécessaire. Depuis les cellules vivantes sont imagés, il est indispensable d&#39;utiliser une chambre environnementale (nous utilisons un de LIS, Suisse), l&#39;oxygène de contrôle, l&#39;humidité, le CO 2 et la température. FRAP est réalisée en utilisant au maximum l&#39;intensité du laser tout en imagerie se fait avec la puissance du laser minimale requise (généralement dans le domaine de 10%, lorsque le niveau de fluorescence est suffisant). Observez les cellules avec une lumière fluorescente de longueur d&#39;onde appropriée et sélectionnez une cellule exprimant la GFP à l&#39;aide d&#39;une lentille d&#39;huile d&#39;immersion 60X. Assurer une bonne distribution subcellulaire. Parfois, lorsque les niveaux d&#39;expression sont trop élevés, la localisation de la protéine peut «déversement» pour les autres compartiments tels que le nucléole. Ces cellules ne doivent pas être sélectionné. </li><li> Maintenant établir un protocole d&#39;imagerie: collecter 3-5 cadres avant le photoblanchiment, puis photobleach au euchromatine ou de l&#39;hétérochromatine (considérés comme des foyers condensée GFP) et recueillir 90 à 120 images après l&#39;photobleach, avec des intervalles ms 250-1000: H1E-GFP, 1000 ms, H1o et HP1-GFP, 250 ms (intervalle de temps des changements en fonction de la dynamique des protéines, où les protéines hautement dynamiques nécessitent du temps plus court intervalle). Nous utilisons normalement l&#39;intensité du laser 80-100% pour les photoblanchiment avec une impulsion laser de 20 à 40 μseconds (1-2 itérations), mais ces chiffres peuvent changer en fonction de la protéine analysée et les niveaux d&#39;expression. Lorsque photoblanchiment est approprié, vous devriez observer un «trou noir» dans votre fluorescence de la GFP. Le trou noir est progressivement re-rempli avec récupération après fluorescence. Bien que le disque tourne peut obtenir jusqu&#39;à près de 60 images par seconde (avec une bonne intensité de la fluorescence et quand en zoomant sur une seule cellule), nous ne recommandons pas d&#39;utiliser le système à de telles vitesses élevées en raison de la qualité d&#39;image à faible et le potentiel de phototoxicité augmenté. </li><li> Pour une expérience FLIP, mis en place un protocole d&#39;imagerie différentes: collecter 3-5 cadres avant le blanchiment, puis lancez répétées de blanchiment, au même endroit tout en collectant des images. Pour H1E-GFP, eau de javel toutes les 5 sec, pour H1o-GFP, eau de javel toutes les 2 sec, et pour HP1-GFP javel toutes les 1 sec. Bleach uned recueillir des images à plusieurs reprises tout au long de l&#39;expérience entière. </li><li> Pour ces deux techniques, répétez le processus sur 20-30 cellules. À des fins statistiques, répéter l&#39;expérience 3 fois ou plus, de préférence à des jours différents. Dans les populations homogènes et paramètres corrects, la déviation standard est généralement faible (&lt;5%). Pour les deux FRAP et FLIP, la taille et la forme de la région blanchi influe sur la dynamique de récupération et doit rester constante au sein d&#39;une expérience. Aussi, lorsque deux cellules sont comparés, les protocoles identiques doivent être utilisés et les cellules doivent être analysés séquentiellement sur la même journée que la puissance laser et d&#39;autres conditions peuvent fluctuer et peuvent affecter le résultat de l&#39;expérience. </li></ol> 4. FRAP et FLIP Data Analysis <ol><li> Dans tous les cadres du PAF recueillies, de mesurer l&#39;intensité de fluorescence dans le ROI (retour sur investissement b = surface blanchie), la zone de fond (ROI BG), et la zone non-blanchie nucléaire (ROI NB) en fonction du temps avant et après le blanchiment. Quand la région est négligeable blanchi le noyau tout entier peut être sélectionné à des fins de normalisation. </li><li> Pour chaque point du temps, de normaliser les données selon la formule: (ROI b - ROI bg) / (nb ROI - retour sur investissement bg) / (b pbROI - pbROI bg) / (nb pbROI - pbROI bg), PB indique pré-blanchi. Pour pré-blanchiment des images, vous devriez obtenir une valeur d&#39;environ 1. La première image après la javel va indiquer la profondeur Bleach. Soustraire la valeur de 1 pour la valeur réelle profondeur Bleach. Répétez l&#39;opération pour chaque cellule et en moyenne 20 à 30 cellules de chaque expérience. </li><li> Dans tous les cadres FLIP recueillies, de mesurer l&#39;intensité de fluorescence dans le domaine non-blanchie nucléaire, et la zone de fond (ROI nb = non blanchi région, ROI bg = fond). Calcul des données FLIP est semblable à une courbe de FRAP, seul le ROI analysé (ROI nb) doit être différent de la région réelle blanchis, ce qui n&#39;est pas utilisé pour le calcul: (ROI NB - ROI bg) / (nb pbROI - pbROI bg) . Il est également possible d&#39;utiliser une cellule voisine (cellule n ROI voisin =) à des fins de normalisation: (ROI NB - ROI bg) / (n ROI - retour sur investissement bg) / (nb pbROI - pbROI bg) / (n pbROI - pbROI bg ). Après la collecte des données, il est possible d&#39;ajuster les données expérimentales à la simulation informatique. Ceci permet le calcul, avec une proximité bien, la fraction mobile, la fraction immobile et la demi-maximale. Nous n&#39;allons pas discuter des aspects mathématiques et statistiques d&#39;analyses FRAP ici et renvoyons le lecteur à d&#39;autres excellentes publications 4-9. La profondeur de l&#39;eau de Javel se réfère à la distance (sur l&#39;axe des y) entre le pré-blanchiment (100%) du signal et la première image, après l&#39;eau de Javel, la fraction mobile se réfère à la distance (sur l&#39;axe des y) entre la profondeur et l&#39;eau de Javel le signal récupéré lors de la cinétique atteint un plateau, et la fraction immobile se réfère à la distance (sur l&#39;axe des y) entre le signal récupéré et le pré-blanchiment (100%) du signal (voir les figures 1B et 2B). Au-delà de cette analyse, il ya de bons modèles mathématiques pour ajuster les données. Pour un exposant unique, l&#39;équation  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="Équation" width="80" /> où t est le temps, A est la fraction mobile, 1-A est la fraction immobile et k est hors la constante de dissociation, peut être utilisé pour ajuster les données, et une estimation directe du taux hors de liaison (k off) peut être obtenus, ainsi que pour le paramètre A, qui peut être utilisé pour calculer le taux de l&#39;association. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. A et B montrent des courbes représentatives du FRAP HP1 (à gauche), H1o (milieu) et H1E (à droite) dans des cellules ES R1. Pour la figure simplicité et la clarté 1A montre les données brutes d&#39;une seule cellule, avant toute normalisation et de calcul. La courbe jaune correspond à la région blanchis, la courbe mauve correspond à la zone non-blanchie nucléaire (lorsque la région est négligeable blanchi le noyau tout entier peut être sélectionné à des fins de normalisation), et la ligne rouge correspond à la fluorescence de fond, qui est minime dans ce cas. Flèche verticale représente le temps l&#39;eau de Javel. Données normalisées et une moyenne est montré dans la figure 1B. Notez la reprise plus lente de H1 (bleu) par rapport à HP1 (rouge). Aussi la variante H1E (bleu foncé) est plus lente que la variante H1o (bleu clair). Fractions mobiles et immobiles et profondeur Bleach sont indiqués pour HP1. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. A et B montrent des courbes représentant FRAP comparant euchromatine (à gauche) avec l&#39;hétérochromatine (à droite) de HP1 dans des cellules ES R1. De même à la figure 1, la figure 2A montre les données brutes d&#39;une cellule unique, courbe jaune correspond à la région blanchis, courbe mauve correspond à la zone non-blanchie nucléaire, et la ligne rouge correspond à la fluorescence de fond. Flèche verticale représente le temps l&#39;eau de Javel. Données normalisées et une moyenne est montré dans la figure 2B. Notez la reprise plus lente de l&#39;hétérochromatine (rouge foncé) par rapport à l&#39;euchromatine (lumière rouge). Fractions mobiles et immobiles et profondeur Bleach sont indiqués pour l&#39;euchromatine. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3.. Une expérience typique FLIP de cellules ES H1o R1 est montré dans la figure 3A (crus, non normalisées de données) et B (données normalisées et moyennées). Dans cette expérience, la courbe mauve correspond à la zone non-blanchie nucléaire, la ligne verte correspond à un noyau de la cellule voisine et la ligne rouge correspond à la fluorescence de fond.

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

Contrairement à la plupart des techniques disponibles, qui impliquent la chromatine purifiée à partir de populations de cellules ou de cellules fixes, des expériences FRAP suivre l&#39;évolution de la dynamique des protéines de la chromatine dans les cellules vivantes. Nous avons trouvé la dynamique des protéines de chromatine d&#39;être un bon indicateur de la plasticité chromatinienne. Cependant, parce qu&#39;il exige la fusion des gènes d&#39;intérêt avec la GFP, l&#39;ajout du marqueur fluorescent peut ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Merck </td><td> 1,04078 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8-même μ-Slides </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) permettra l&#39;étude de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes avec une résolution spatiale et temporelle bien. Nous décrivons ici comment effectuer FRAP et FLIP dosages des protéines de la chromatine, notamment H1 et HP1, chez la souris souches embryonnaires (ES) cellules. Dans une expérience de FRAP, les cellules sont transfectées, soit transitoire ou stable, avec une protéine d&#39;intérêt fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou leurs dérivés (YFP, CFP, cerise, etc.) Dans le transfectées, les cellules fluorescentes, un faisceau laser intense concentré blanchit une région relativement petite d&#39;intérêt (ROI). La longueur d&#39;onde laser est choisie en fonction de la protéine fluorescente utilisée pour la fusion. La lumière du laser blanchit de manière irréversible le signal de fluorescence des molécules dans le retour sur investissement et, immédiatement après le blanchiment, la récupération du signal fluorescent dans la zone blanchie - médiatisé par le remplacement des molécules blanchie avec les molécules non blanchie - est contrôlée au moyen d&#39;imagerie laps de temps. Les courbes générées récupération de fluorescence fournir des informations sur la mobilité de la protéine. Si les molécules fluorescentes sont immobiles, aucune récupération de fluorescence est observée. Dans une approche complémentaire, la perte de fluorescence dans le Photobleaching (FLIP), le faisceau laser blanchit au même endroit à plusieurs reprises et l&#39;intensité du signal est mesuré ailleurs dans la cellule fluorescente. Expériences FLIP donc mesurer la carie signal plutôt que la récupération de fluorescence et sont utiles pour déterminer la mobilité des protéines ainsi que la protéine navette entre compartiments cellulaires. Contraignante transitoire est une propriété commune de la chromatine protéines associées. Bien que la fraction majeure de chaque protéine chromatine est lié à la chromatine à tout moment à l&#39;état stationnaire, la liaison est transitoire et la plupart des protéines de chromatine ont un chiffre d&#39;affaires élevé sur la chromatine, avec un temps de séjour dans l&#39;ordre des secondes. Ces propriétés sont cruciales pour générer une grande plasticité dans l&#39;expression du génome 1. Expériences de photoblanchiment sont donc particulièrement utiles pour déterminer la plasticité chromatinienne utilisant la GFP-fusion des versions de la chromatine des protéines structurelles, en particulier dans les cellules ES, où l&#39;échange dynamique de protéines de chromatine (y compris les protéines hétérochromatine 1 (HP1), un linker histone H1 et histones) est plus élevé que dans les cellules différenciées 2,3.

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Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Nous décrivons les méthodes de récupération, y compris photoblanchiment de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) pour suivre la dynamique des protéines dans la chromatine souches embryonnaires (ES) cellules. La dynamique des protéines de la chromatine, ce qui est considéré comme l&#39;un des moyens d&#39;étudier la plasticité de la chromatine, est augmentée dans les cellules pluripotentes.

Photobleaching essais (FRAP et FLIP) pour mesurer la dynamique des protéines de la chromatine dans Vivre cellules souches embryonnaires

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

27.0K vues.  The Hebrew University of Jerusalem. Nous décrivons les méthodes de récupération, y compris photoblanchiment de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence En Photobleaching (FLIP) pour suivre la dynamique des protéines dans la chromatine souches embryonnaires (ES) cellules. La dynamique des protéines de la chromatine, ce qui est considéré comme l'un des moyens d'étudier la plasticité de la chromatine, est augmentée dans les cellules pluripotentes.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Recherche

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Modélisation des cellules souches embryonnaires utilisant la puce Bio Retourner

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

L&#39;utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...