Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement: Armée-UNL Centre de Mécanique des traumatismes (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Chandra Namas), Prix Layman UNL (-001 26-1110-0033 , PI: Lim).

1. Culture de cellules neuronales <ol><li> Les cellules du cerveau, y compris les cellules neuronales, les astrocytes, et leur co-culture peut être utilisé comme modèle cellulaire. Comme une démonstration de faisabilité, la pressurisation impulsif de lignées cellulaires des cellules neuronales est présenté. </li><li> SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain (ATCC, CRL-2266) sont cultivées sur des lamelles de verre de 18 mm de diamètre. Les cellules sont ensemencées à une densité de 3 x 10 3 cellules / cm 2 en utilisant les milieux de croissance composé de DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine. Diapositives de cellules cultivées en verre sont conservés dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié à 37 ° C. </li><li> Pour obtenir la différenciation des cellules neuronales des cellules SH-SY5Y, les cellules sont traitées avec des médias plus supplémentés avec 10 uM d&#39;acide rétinoïque (RA) pendant 7 jours avec les médias changés tous les deux jours. Au jour 7, les cellules sont prêts à être mis sous pression. </li></ol> 2. Equipement de pressurisation: Kolsky Bar <ol><li> La barre Kolsky, dedéveloppé par Kolsky 1 en 1949, a été utilisé pour mesurer les propriétés mécaniques d&#39;un matériau à un taux de charge très élevée. L&#39;appareil est constitué de deux barres avec un échantillon mis en contact entre les barres. Une vague de stress, créé sur la barre incident, se propage à l&#39;échantillon où la vague se divise en une onde réfléchie et transmise. La contrainte dans l&#39;échantillon est proportionnelle à l&#39;onde émise. Dans cette étude, nous utilisons une chambre de pressurisation cellule pour être placé entre les deux barreaux de la Kolsky set-up. </li><li> Les deux barres en alliage d&#39;aluminium (chacun 6-m de long) sont suspendues par des paliers alignés en laiton, et une chambre de pressurisation vitro de cellules est prise en sandwich entre les barres. La barre est en amont de la barre incident avec une masse £ 130 serré sur une extrémité. Dispositif de serrage à friction est placé dans une position qui donne la durée d&#39;impulsion souhaitée. En engageant la pince de serrage et un vérin ciseaux entre la masse et un support de chargement, la section de serrage de la barre de masse incident est pré-compressed au niveau souhaité. Forcer un verrou qui bloque l&#39;encoche de serrage à une rupture brutale d&#39;un système hydraulique de compression libère le pré-enregistrées rapidement et génère ainsi une impulsion de pression. Cette propage à travers la barre d&#39;incident, entraîne le piston chambre d&#39;essai, et pressurise le fluide et les cellules à l&#39;intérieur de la chambre de manière impulsive. La pressurisation chambre déclenche à son tour une impulsion de pression se propageant dans l&#39;aval de la barre transmissibles. Les souches associées à des impulsions de pression dans les barres sont mesurées composé de haut jauges de contrainte à résistance excités à 45 volts. Les signaux des jauges sont enregistrées avec un oscilloscope numérique à 1 MHz comme une histoire de chargement. </li><li> Dans la chambre de pressurisation vitro de cellules est constitué d&#39;un piston-cylindre. Le cylindre a 2,6 cm de diamètre intérieur et de 3,8 cm de diamètre externe, et comporte un trou taraudé petite à la base de la cavité. Le trou sert à air et l&#39;excès de liquide lors de l&#39;installation échantillon de cellules. Le piston est de 7,5 cm de longet est fabriqué à partir du matériau même barre. Le piston est enveloppé avec deux à trois couches de (téflon) plombier bande servant de joint d&#39;étanchéité à faible frottement. L&#39;embout est de 32 mm de long et possède deux petites vis en acier inoxydable qui maintiennent les lamelles de verre (sur lequel les cellules sont mises en culture) lors du chargement. </li></ol> 3. La pressurisation impulsif des cellules neuronales <ol><li> Toutes les parties de la chambre de pressurisation sont stérilisés à l&#39;aide de l&#39;autoclave et sont conservées sous une lumière UV. L&#39;ensemble de la chambre est réalisée à l&#39;intérieur de la hotte de culture cellulaire. La vis de purge dans la chambre est plus ou moins engagée dans la prise d&#39;air à la base de la cavité. Préchauffé (37 ° C) milieu de croissance frais est introduit à la pipette dans la chambre sans faire de bulles. Ensuite, une lame de verre cellulaire cultivée est capté, et est placé sur le capuchon du piston (cellules faisant face à l&#39;extérieur). Les petites vis de fixation sont serrées sur la lame pour le maintenir en place. Le piston avec une lame de verre cellulaire cultivée est inséré un petit into la cavité de la chambre, et l&#39;ensemble est incliné par l&#39;évent étant au plus haut point. La vis de purge est éliminé et le piston est poussé dans la cavité de première force sur des bulles d&#39;air, puis l&#39;excès de liquide. Soit une marque de référence ou un gabarit est utilisé comme un guide pour assurer le même volume de support de culture pour chaque essai. La dimension axiale des médias dans la chambre est d&#39;environ 6 mm. Désinfectez la vis de purge et de le remplacer pour rendre l&#39;eau chambre étanche. La chambre ne doit pas fuir sous cette charge statique, si c&#39;est le cas, l&#39;enveloppe en téflon doit être remplacé ou renforcé. </li><li> À ce stade, le système de barre Kolsky est remis à zéro. La masse lourde est ramené à sa position initiale et un nouveau boulon de verrouillage remplace l&#39;occasion (cassé) une. Engager le nouveau boulon de verrouillage avec le système hydraulique à environ 200 psi. Utilisez le cric ciseaux pour comprimer la section de pré-chargement de la barre de l&#39;incident jusqu&#39;à une pression légèrement supérieure à la valeur désirée, puis la couper pour engager la friction complet de lavis du cric. L&#39;acquisition des données est maintenant armé. </li><li> La chambre de mise sous pression monté cellule est montée dans le système. Elle est placée dans un bloc de V supporté par petit vérin ciseaux laboratoire et aligné avec les deux barres. Graisser chaque interface avec une couche de graisse légère et frottez les surfaces d&#39;aboutement ensemble pour éliminer les espaces d&#39;air entre les deux. </li><li> Le test est maintenant prêt à procéder. Le verrou de serrage est contraint de briser rapidement par le conducteur de pompage pince hydraulique. La pince se séparent et l&#39;acquisition des données doit afficher les résultats. L&#39;historique de pressurisation cellule est déterminée à partir des mesures de la jauge de la barre transmis. Si la barre de transmission utilisée est assez longue, cela ne devrait être le premier trouble au point où les mesures montrent une pression négative. La durée de l&#39;impulsion émise peut être plus courte que l&#39;impulsion incidente si une bulle est piégé. L&#39;ampleur ne peut atteindre celle de l&#39;impulsion incidente, mais il doit avoir une lon suffisammentg plateau avant le déchargement. Autrement, supporte une grande bulle d&#39;air dans la chambre étanche ou un défaut d&#39;alignement entre l&#39;ensemble et une barre a pu se produire. </li><li> La chambre de pressurisation cellule est ensuite retirée et démontée à l&#39;intérieur de la hotte de culture cellulaire. La vis de purge est éliminé et le piston libre est tiré de la chambre. La lame de verre cellulaire cultivée est tiré de l&#39;extrémité du piston. </li></ol> 4. Évaluation du comportement cellulaire sous pression <ol><li> Après pressurisation, les cellules peuvent être inspectés immédiatement ou à terme en incubation pendant un examen ultérieur. Avec la conduite des processus de fonctionnement d&#39;asepsie, à plus long terme de post-incubation est possible. </li><li> Cellules pressurisées peut être examiné par toutes les techniques de biologie moléculaire et cellulaire. Plus précisément pour la pressurisation des cellules neuronales, pour étudier la physiologie cellulaire et moléculaire dans des conditions TBI, les essais de pression d&#39;évaluer les changements induits dans la croissance des neurites, le changement des microtubules du cytosquelette, EXPRE gène neuronalession, apoptose, etc, peuvent être réalisées. Que des échantillons de cellules, des cellules de contrôle qui sont mises en culture, la même maintenu à l&#39;intérieur de la chambre de pressurisation pour la même période de temps, mais pas sous pression sont utilisés (dite chambre de commande). </li><li> Permettant d&#39;évaluer les variations de la croissance des neurites, les cellules de commande sous pression et la chambre sont examinées au microscope optique immédiatement après pressurisation et 1 h 24 et de post-incubation. Un exemple d&#39;images de cellules neuronales sont présentés dans la section «Les résultats représentatifs» (Figure 2). La modification de la longueur des neurites peut être quantifiée par l&#39;actine immunofluorescence et analyse d&#39;image. Les cellules sont fixées avec une solution de paraformaldéhyde en poids / volume de 4%, on rince avec un 0,05% v / v de Tween-20 de tampon de lavage, et perméabilisées avec un 0,1% v / v de Triton X-100 solution. Après blocage avec une solution à 1% p / v de sérum-albumine bovine, les cellules sont incubées avec de l&#39;isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC)-conjugué phalloïdine. Images par immunofluorescence des cellules sont prélevées à l&#39;aide d&#39;une lampe fluorescentemicroscope et la longueur des neurites des cellules sous pression et de commande sont quantifiés à l&#39;aide du logiciel ImageJ (NIH). </li><li> Les neurites peuvent être identifiés comme des axones ou dendrites. Pour évaluer les changements morphologiques dans les axones ou dendrites, les expériences décrites ci-dessus peut être répété en utilisant la détection d&#39;anticorps chaque structure, c&#39;est-neurofilaments (NF) anticorps pour les axones et les microtubules associated protein (MAP2) anticorps pour dendrites. </li><li> Les microtubules sont un des éléments clés du cytosquelette des neurones, et les dommages aux microtubules a été utilisé comme marqueur de lésion neuronale. 2 microtubules peuvent être visualisées par immunofluorescence en utilisant l&#39;anticorps β-tubuline. Les cellules sont fixées après 0 h et 24 h de l&#39;après-pressurisation, tachée de β-tubuline, et observé par microscope à fluorescence. </li><li> Pour évaluer l&#39;effet de la pression impulsive sur l&#39;expression génique neuronale apoptotique et, l&#39;ARN total est extrait des cellules sous pression et de contrôle. Genl&#39;expression e peut être examiné en effectuant RT-PCR quantitative en temps réel ou RT-PCR, semblable à nos protocoles publiés 3. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Un exemple de profil de pression appliquée sur les cellules à l&#39;intérieur de la chambre de pressurisation. Le dispositif génère succès barre Kolsky 2 niveau MPa, pression de type mono-impulsion impulsive avec une durée d&#39;environ 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Un exemple de réponse neuronale à la pressurisation impulsif. SH-SY5Y exposées à la pressurisation impulsif à 2 MPa spectacle distincte des neurites / axone rupture par rapport aux cellules témoins chambre. 6. Difficultés et solutions <ol><li> Chambre d&#39;étanchéité est l&#39;un des principaux obstacles à surmonter. Il est found que les disques larges avec des joints toriques ont un problème de gougeage et une friction accrue. Afin d&#39;éliminer les effets de frottement, ainsi que de prévenir le gougeage, une méthode simple de ruban adhésif piston avec du ruban téflon plombier est utilisé. Cela résout les problèmes et produit le niveau de pression désiré et la durée. </li><li> Sous pression le comportement des cellules neuronales, en particulier lors de l&#39;évaluation secondaires mécanisme de TBI ou des effets à plus long terme, doivent être examinées après un long temps de post-incubation. La chambre contenant les cellules est exposé à des conditions potentiellement non stérile tout en se déplaçant à la barre Kolsky, de pressurisation, et de revenir à la hotte de culture cellulaire. Avec pré-stérilisation des parties de la chambre et le bon fonctionnement de montage / démontage de la lame culture cellulaire et de la chambre à l&#39;intérieur de la hotte de culture cellulaire, à plus long terme de post-incubation est possible jusqu&#39;à plusieurs semaines. </li><li> La reproductibilité des données est un paramètre important dans la stimulation cellulaire expériences mécaniques. Pour notre dispositif, la reproducibility en réponse neuronale est déterminé comment le profil souhaité de pressurisation impulsif, du niveau de pression à la fois et la durée, est à plusieurs reprises obtenu. Depuis, nous enregistrons le profil de pression obtenu pour chaque pression, les données de réponse des cellules du profil de pression indésirables peuvent être exclus manuellement par la suite. </li><li> Les étapes de pressurisation entières, y compris le montage de chambre, de transfert et de monter dans la barre Kolsky, la pressurisation, le transfert de l&#39;arrière, et la chambre de démontage, prendre moins de 10 minutes. La diapositive suivante culture cellulaire peut être mis sous pression immédiatement après la mise sous pression précédente. Ainsi, un nombre suffisant d&#39;expériences de pressurisation peut être complété de manière efficace. Notre set-up utilise des lamelles de 18 mm de diamètre en verre. Une expérience de pressurisation ne fournit pas assez de protéines pour Western blot en raison de la taille du substrat (et aussi parce que certaines des cellules sont mortes sous pression). Environ trois expériences répétées de pressurisation fournir une quantité de protéines nécessaire pour immunoblOtting. Encore une fois, la reproductibilité est vérifiée à chaque fois avec le profil de pression. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Beaucoup de techniques expérimentales in vitro ont été tentées pour étudier les dommages aux cellules du cerveau dans des conditions TBI. Il s&#39;agit notamment de neurone / astrocytes étirement, induites par l&#39;écoulement de cisaillement, chute de poids, lacération stylet, laser transection, lithotripsie, etc 4,5 Il a été supposé que la surpression de courte durée est un facteur dominant pour TBI physiques. Surtout 6,7 , l&#39;onde de choc de l&#39;explosion TCC a une durée d&#39;impulsion de l&#39;ordre de quelques millisecondes. 4 Sur la base de cette hypothèse et de l&#39;observation, de la chambre baromètre capable de pressurisation transitoire a été mis au point et utilisé pour évaluer le comportement des cellules du cerveau dans des conditions TBI. Par exemple, dans le liquide de la chambre de percussion barotraumatisme une impulsion de pression avec 20-30 ms longue durée et une pression de crête allant jusqu&#39;à 0,5 MPa a été utilisée pour examiner le comportement des cellules gliales humaines dans TBI. 6 Récemment, VandeVord et al. 7 métal utilisé chambre baromètre frappe de balle d&#39;examiner la astrocytescomportement sous TBI, mais la boule de métal frappant produit des impulsions de pression multiples. Dans cette étude, nous avons développé un dispositif de pressurisation nouvelle cellule qui génère de pressurisation de type mono-impulsion impulsif. L&#39;appareil a été développé sur la base de la barre Kolsky set-up, qui a été utilisé comme un appareil d&#39;essai de matériaux dans nos 8 et celle des autres études. 1,9 bar La capacité Kolsky du matériel de test à taux de charge très élevée a été modifié afin d&#39;être en mesure de appliquer une seule impulsion de surpression de type à des cellules cultivées dans la chambre de mise sous pression (figure 1). Nous pourrions réussir à contrôler l&#39;ampleur et la durée de la surpression impulsif. En tant que représentant de la réponse cellulaire, nous avons démontré que moins 2 MPa de pression cellules SH-SY5Y neuronales afficher des neurites importante et la perte axonale par rapport aux cellules témoins non pressurisées de chambre. En conclusion, nous avons développé un nouveau dispositif de pressurisation impulsif cellule en utilisant un spécialement conçu Kolskyet un dispositif de barre démontré son utilisation potentielle dans les enquêtes sur la réponse neuronale dans des conditions TBI. Nous notons également que cette technique est très polyvalent en ce que tout type de cellules peuvent être exposées à des pressions impulsives à différents niveaux et la durée. Par conséquent, l&#39;appareil peut être utilisé pour étudier la impulsive induite par la pression mécanotransduction cellulaire comportement, non seulement pour blesser les cellules, mais aussi pour stimuler les cellules positivement dans leur fonction et la détermination du destin.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) cellules de neuroblastome humain </li><li> 18 mm de diamètre lamelles de verre </li><li> Milieux de culture cellulaire: DMEM, 10% de sérum de veau foetal, 1% de pénicilline-streptomycine </li><li> L&#39;acide rétinoïque (10 uM) pour la neurogenèse induisant </li><li> Kolsky bar dispositif de pressurisation impulsif </li><li> Piston-cylindre chambre de pressurisation cellule </li><li> Vis en acier inoxydable pour la fixation lamelle de cellules cultivées sur le piston </li><li> Graisse pour interfaces entre cellules chambre et Kolsky bar </li><li> Fournitures générales de biologie moléculaire pour l&#39;évaluation de la réponse cellulaire à une pressurisation (fixateur, anticorps, colorant fluorescent, fournitures PCR, etc) </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

Un roman expérience impulsif pressurisation cellulaire a été développé en utilisant un dispositif bar Kolsky d&#39;enquêter explosion provoquée par une lésion cérébrale traumatique (TBI). Nous montrons dans cet article comment la vidéo blast-TCC pertinente pression impulsive est appliquée aux cellules neuronales in vitro. Ceci est réalisé à l&#39;aide d&#39;impulsions de pression bien contrôlée créée par un dispositif Kolsky barreau spécialisé, avec historique de la pression complète dans la chambre de pressurisation cellulaire enregistré. Pression cellules neuronales sont inspectés immédiatement après pressurisation, ou encore incubé à examiner les effets à long terme de pressurisation impulsif sur neurites / axonale excroissance, l&#39;expression des gènes des neurones, l&#39;apoptose, etc Nous avons observé que la pressurisation impulsif à environ 2 MPa induit une perte nette par rapport neurites pour les cellules non pressurisé. Notre technique permet une nouvelle méthode pour étudier les mécanismes moléculaires / cellulaires de souffle TBI, par l&#39;intermédiaire de pressurisation impulsif des cellules du cerveau à bien contrôlée prEssure ampleur et la durée.

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Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Un roman expérience impulsif pressurisation cellulaire a été développé en utilisant un dispositif bar Kolsky d&#39;étudier les mécanismes moléculaires / cellulaires de haut-induit un traumatisme crânien.

La pressurisation impulsif de cellules neuronales pour l&#39;étude de lésions cérébrales traumatiques

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K vues.  University of Nebraska-Lincoln. Un roman expérience impulsif pressurisation cellulaire a été développé en utilisant un dispositif bar Kolsky d'étudier les mécanismes moléculaires / cellulaires de haut-induit un traumatisme crânien.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Surfaces Micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Recherche

Bio-ingénierie

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Luminescence Resonance Energy Transfer pour étudier les changements conformationnels dans des protéines membranaires exprimés dans les cellules de mammifères

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

Formation Les personnes ayant une lésion médullaire à l&#39;aide d&#39;un ambulate exosquelette motorisé

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Ciblage des fibres neuronales Tracts pour la thérapie de Stimulation cérébrale profonde à l’aide de modèles interactifs, spécifiques à un Patient

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

L’acide hyaluronique basée Hydrogels pour 3-Dimensional Culture de cellules de glioblastome dérivé de Patient

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...