Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lésions cérébrales traumatiques préjudiciables à l’explosion et peut être utilisée pour dépister les médicaments neuroprotecteurs avant l’utilisation de modèles Vivo plus complexes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise un instrument de laboratoire pour exposer le tissu cérébral de masse in vitro à une onde de choc à l’aide d’un protocole de débit simple et élevé qui permet la création d’une lésion reproductible. Tout d’abord, insérez des anneaux stériles en acier inoxydable sur mesure dans les puits d’une plaque de six puits.
Ajouter ensuite un milieu expérimental sans sérum préchauffé avec de l’iodure de propidium aux puits en veillant à ce que le niveau de milieu n’atteigne pas au-dessus de l’encoche de l’anneau. Transférer la plaque à l’incubateur pendant une heure pour s’assurer que le milieu est à 37 degrés Celsius avant que les inserts de culture tissulaire ne soient transférés. Après une heure, transférer les inserts de culture tissulaire avec des tranches organotypiques de leurs plats de croissance sur les anneaux dans l’assiette de six puits.
Faites un point sur la jante d’insertion dans la position de trois heures avec un stylo marqueur permanent pour faciliter le retour des inserts à sa position d’origine, puis étiquetez chaque plaque de six puits avec un nom unique et la date et faire une carte des puits de chaque plaque, nommant chaque puits avec une lettre et chaque tranche dans le puits avec un nombre de sorte que chaque tranche a un identificateur unique. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour s’assurer que les tranches sont à 37 degrés Celsius immédiatement avant l’imagerie. Une heure après le transfert vers un milieu expérimental, évaluez la santé des tranches en imagerie rapide de chaque tranche individuellement et séquentiellement sous faible puissance.
Utilisez un microscope à fluorescence muni d’un filtre d’excitation et d’émission approprié idéalement dans une pièce sombre ou une pièce à faible lumière. Gardez le couvercle sur la plaque lors de l’imagerie. Une certaine condensation peut s’accumuler à l’intérieur du couvercle.
Si cela se produit, utilisez brièvement un sèche-cheveux sur le réglage bas à l’extérieur du couvercle. Assurez-vous que les conditions d’imagerie sont identiques à différents jours et entre les expériences. À la ligne de base, les tranches saines montrent très peu de taches fluorescentes.
Les tranches qui présentent des zones de coloration rouge dense indiquent une viabilité compromise et devraient être exclues d’une analyse plus approfondie. À titre de comparaison, la fluorescence de la tranche blessée par explosion à 72 heures est indiquée ici. Immédiatement après l’imagerie, retirez un insert de culture tissulaire de la plaque de six puits et transférez soigneusement l’insert dans un sac stérile en polyéthylène contenant 20 millilitres de milieu expérimental préchauffé bouillonné avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.
Retirez soigneusement les bulles d’air et scellez le sac stérile en tordant le dessus et en appliquant une pince en plastique. Assurez-vous que chaque sac stérile est correctement étiqueté avec la plaque et l’identification du puits. Après avoir transféré chaque insert de culture tissulaire dans un sac stérile individuel, placez les sacs et les six plaques de puits avec milieu expérimental dans l’incubateur de 37 degrés Celsius.
Après une heure, emballez soigneusement les sacs stériles avec les inserts de culture tissulaire dans des boîtes en plastique à l’intérieur d’une boîte thermique réglementée remplie d’eau ionisée à 37 degrés Celsius. L’eau doit maintenir les tranches organotypiques à température physiologique tout au long du protocole d’exposition aux ondes de choc. Portez des bottes de protection à ornées d’acier, un manteau de laboratoire et des gants pendant la préparation du tube de choc et de l’exposition aux ondes de choc.
Utilisez une tige de blanchissage pour boulonner le cadre stérile du porte-sac à la bride distale tube de choc assurant que le trou central est aligné avec la sortie du tube de choc. Le capteur un, un transducteur de pression, est situé dans la partie centrale de la section entraînée, et le capteur deux se trouve dans la bride distale du tube de choc. Connectez ces transducteurs de pression à un oscilloscope à travers une unité d’alimentation source actuelle et allumez l’oscilloscope.
Assurez-vous que la valve solénoïde et le contrôle du débit du tube de choc sont fermés, puis ouvrez la ligne d’air comprimé externe et chargez la valve solénoïde à 2,5 barres. Ouvrez la soupape de sécurité du cylindre d’air comprimé et ouvrez lentement le régulateur de pression pour augmenter la pression à environ cinq barres. Ensuite, préparez des diaphragmes en coupant 23 feuilles de polyester épaisses de micron en carrés de 10 par 10 centimètres carrés.
Préparez les poignées à partir de ruban autoclave et collez-les au haut et au bas de chaque diaphragme. Placez un diaphragme dans la brèche et assurez-vous qu’ils sont centrés. Ensuite, serrez le diaphragme à l’aide de quatre boulons et écrous M24.
Façonnez-les séquentiellement d’une manière symétrique diagonale tout en veillant à ce que les diaphragmes soient exempts de rides. Serrez un sac stérile en position verticale sur le cadre du support en veillant à ce que la surface de la culture tissulaire insérée avec les tranches hippocampiques organotypiques soit orientée vers la sortie du tube de choc et que l’insert de culture tissulaire soit centré à l’intérieur du sac stérile. Pour la configuration du double diaphragme, la pression d’éclatement dépend du différentiel de pression de gaz entre le conducteur et la chambre de double brèche.
Par conséquent, pour que les diaphragmes éclatent de manière contrôlée, la soupape de sécurité double brèche est ouverte manuellement une fois que les pressions de la cible sont atteintes. Mettez sur les défenseurs de l’oreille et les lunettes de sécurité si elle n’est pas déjà portée. Fermez la valve solénoïde.
Allumez l’unité d’alimentation source actuelle pour obtenir les données d’onde de choc. Manipulez le bouton de commande d’écoulement sur le panneau de commande de tube de choc pour pressuriser lentement la section de volume de conducteur du tube de choc pour la configuration simple de diaphragme ou la section de volume de conducteur et la section double brèche du tube de choc pour la configuration double de diaphragme. Dès que le diaphragme se rompt, a rapidement fermé le flux d’air comprimé à l’aide du bouton d’écoulement et d’ouvrir la valve solénoïde.
La combinaison idéale de paramètres d’onde de choc devrait être suffisante pour causer des lésions tissulaires, mais pas si élevé qu’il provoque l’insertion de la culture tissulaire ou la distorsion ou la rupture stérile sac. Après avoir exposé chaque tranche à une seule onde de tube de choc, retournez-la immédiatement à la boîte thermiquement réglée. Ensuite, prenez le sac stérile suivant de la boîte et serrez-le sur le cadre du support.
Effectuez l’interrupteur en douceur et rapidement pour empêcher le refroidissement du milieu expérimental, car des températures inférieures à 37 peuvent nuire au développement des blessures. Une fois que tous les inserts de culture tissulaire ont été exposés à une onde de choc ou à un protocole factice, retournez les inserts de culture tissulaire à leurs puits dans la plaque originale de six puits et retournez à l’incubateur jusqu’à nouvel ensemble. Cette image est un exemple représentatif d’une onde de choc obtenue à l’aide d’un film polyester de 23 microns d’épaisseur avec une surpression de pic kilopascal de 55 kilopascales.
La vitesse de l’onde de choc était de 440 mètres par seconde. Les ondes de choc de surpression de crête de 50 et 55 kilopascal ont causé des dommages significatifs qui se sont développés tout au long du protocole de 72 heures par rapport au groupe factice. La blessure résultant d’une exposition aux ondes de surpression de pointe de 55 kilopascales était significativement plus élevée qu’après 50 kilopascal à 48 heures et 72 heures, démontrant que le développement de la blessure est proportionnel à l’intensité de l’onde de choc.
Cette image montre une tranche 72 heures après une explosion de 50 kilopascales. Un niveau élevé de blessures diffuses est visible. Les blessures sont plus prononcées après un pic de surpression de 55 kilopascal.
Cette image de fluorescence d’iodure de propidium montre une tranche organotypique d’une expérience simulée. La tranche factice montre de faibles niveaux de fluorescence. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une technique aseptique partout pour éviter la contamination du tissu et pour manipuler les cultures de tissu rapidement mais très doucement pour éviter des dommages involontaires de cellules.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme la coloration par immunofluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme quels sont les mécanismes de la mort cellulaire impliqués dans des lésions cérébrales traumatiques induites par l’explosion? Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la neuroprotection d’explorer le potentiel des médicaments pour prévenir la propagation de la mort cellulaire et des tissus cérébraux après l’exposition aux ondes de choc.
