Cette recherche a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) sous le numéro subvention FO 315/4- et l&#39;Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° HEALTH-F2-2009-241778 à CF.

1. Ensemencement des cellules endothéliales en plaques à puits <ol><li> Cultiver le cerveau des cellules endothéliales microvasculaires murins (CEND) en T75 flacon de culture, changer le milieu (DMEM contenant 10% de FCS, 50 U / ml de pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine) deux fois par semaine, jusqu&#39;à la confluence est atteinte. (Pour la génération et l&#39;immortalisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, s&#39;il vous plaît voir Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.). </li><li> Laver les cellules avec un tampon phosphate salin (PBS). Retirez le PBS et trypsiniser les cellules avec 2 ml de solution chaude de trypsine-EDTA. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 minutes ou jusqu&#39;à ce que la couche de cellules est dispersé. </li><li> Ajouter milieu de culture 8 ml dans les cellules. Appuyez sur le flacon plusieurs fois pour détacher les cellules. </li><li> Voir les cellules sous le microscope afin d&#39;assurer un détachement complet du flacon. </li><li> Moyen pipette avec des cellules individuelles de haut en bas. Agiter le flacon pour mélanger le suspensi cellulairesur. </li><li> Prenez 20 pi de la suspension cellulaire, mis dans un hémocytomètre et compter le nombre de cellules. </li><li> Déterminer la densité de cellules et de semences 20.000 cellules / cm 2 dans le puits. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans collagen1 préenduites plaques de culture 6 puits à fond souple (57,75 cm 2) dans un volume total de 3 ml / puits. Chaque puits a une superficie de 9,62 cm 2. </li><li> Cultiver les cellules à 37 ° C pendant une semaine jusqu&#39;à confluence. Changer le milieu de culture deux fois par semaine. </li></ol> 2. La différenciation cellulaire avant l&#39;accident Stretch-induite <ol><li> Changer le milieu de culture des cellules avec un milieu de différenciation (DMEM contenant 1% de sérum de veau foetal dépourvu de sérum dépouillé (ssFCS), 50 U / ml de pénicilline / streptomycine). </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 24 heures. </li></ol> 3. Blessure Stretch-induite des cellules endothéliales <ol><li> Allumez le dispositif de commande de la lésion des cellules. </li><li> Définissez le délai à 50 msec. </li><li> Régler la pression du régulateur à 15 psi et appuyez sur le déclencheur plusieurs fois jusqu&#39;à ce que la pression maximale recommandée est stable. </li><li> Régler la pression du régulateur à la valeur désirée. Utiliser le tableau 1 comme un guide pour générer différents degrés de blessures d&#39;étirement. </li><li> Placer la plaque de culture à fond souple 6 puits (57,75 cm 2) dans le support de plateau. Assurez-vous que le sélecteur est bien réglé à la taille bien correct (ie grand bien). </li><li> Placez l&#39;adaptateur fermement au-dessus du puits. Tenir la prise fermement en place avec une main pendant que l&#39;autre main appuie sur le déclencheur. </li><li> Notez la pression maximale générée. </li><li> Mettre immédiatement la plaque arrière dans le 37 ° C incubateur pour la durée souhaitée ou utiliser immédiatement pour réussir expériences ou d&#39;évaluation. </li></ol> 4. Évaluation du préjudice extensible par Essai de fixation du colorant <ol><li> Immédiatement après que les cellules étaient strgravée (étape 3.7), ajouter 30 ul d&#39;une solution à 1 mg / ml de la viabilité tache qui agit comme un marqueur de cytotoxicité (voir le tableau complémentaire des matériels et équipements) dans le milieu de culture cellulaire (Note: 10 pl de la solution de colorant doit être utilisé pour chaque ml de milieu de culture cellulaire). </li><li> Lors de l&#39;ajout du colorant dans les cellules, voir immédiatement sous un microscope à fluorescence. </li></ol> 5. Évaluation du préjudice extensible par lactate déshydrogénase (LDH) de presse <ol><li> Immédiatement après l&#39;étirement des cellules (étape 3.7), supprimer 200 ul de milieu de culture cellulaire à partir du puits. Faites de même pour chaque point de post-blessure fois que vous souhaitez inclure dans votre enquête sur la libération de LDH (ie par exemple 30 min, 1 h, 2 h, etc.) </li><li> Centrifuger le milieu de culture cellulaire au réglage le plus élevé d&#39;une micro-centrifugeuse pendant 5 min pour enlever les débris de cellules. Retirer le surnageant et l&#39;utiliser pour les étapes suivantes. </li><li> Une fois que vous hAve a terminé l&#39;étape 5.1 et ont pris les échantillons nécessaires vous aimeriez avoir des différents points dans le temps que vous souhaitez étudier, la lyse des cellules en utilisant la solution de lyse inclus dans le kit test LDH (s&#39;il vous plaît voir le tableau complémentaire des matériels et équipements). </li><li> Mettez 100 pi de milieu de dosage inclus dans l&#39;essai kitto chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits fourni dans le kit. </li><li> Mettez 100 pi de milieu de culture cellulaire dépourvu de cellules dans deux puits parallèles d&#39;une plaque de 96 puits inclus dans le kit de dosage. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 492 nm. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les effets des blessures mécaniques in vitro ont été étudiés et les méthodes ont été établies pour les astrocytes, neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales aortiques 8, 9, 22. Il est, cependant, à ce jour, toujours pas connue modèle in vitro de blessures étirement dans les cellules endothéliales cérébrales en culture in. Des modèles cellulaires de traumatisme offrent des avantages précieux sur des modèles animaux que l&#39;environnement mécanique des cellules peut être contrôlée avec précision 6. Par conséquent, un modèle in vitro pour un traumatisme à cause de blessures d&#39;étirement en utilisant des cellules du cerveau endothéliales cultivées dans cet acte comme modèle de la barrière hémato-encéphalique (BHE) comme quoi notre protocole présentes peuvent s&#39;avérer utiles. Ce protocole utilise des cellules CEND, un modèle du Bureau établi dans notre laboratoire. Depuis Bureau répartition est souvent documentée chez les patients ayant subi un TCC et TBI est souvent liée à la perturbation du Bureau qui peut entraîner la formation de l&#39;œdème 23, 24, la méthode presuvre ici peut notamment être utilisé dans la réalisation d&#39;études BBB par rapport au TBI. Dans ce modèle, il est important de prendre soin de combien de gravité de la blessure d&#39;étirement est appliquée aux cellules. Dans la mesure où les cellules sont blessées en tout cas, et avec ce niveau de pression est appliquée, la gravité des blessures qui peuvent influer sur les cellules endothéliales diffère pas beaucoup de beaucoup d&#39;autres types de cellules. Cellules endothéliales aortiques sont plus résistants à étirer blessures que les astrocytes ou cellules gliales mixtes 9. En outre, ils réparent plus rapidement après une blessure par rapport aux autres types de cellules. Par conséquent, pour les cellules endothéliales du cerveau, en particulier des cellules CEND, une plus grande quantité de blessures d&#39;étirement est nécessaire pour produire un degré élevé de blessure. On pourrait atteindre le degré de blessure souhaité en appliquant la pression correspondant indiqué dans le tableau 1. Pour les cellules CEND, cependant, des blessures graves est préféré en raison de leur résistance à la traction. Les analyses effectuées ont montré LDHque, lorsque le degré d&#39;étirage augmente, plus la LDH est sécrétée dans le surnageant. En revanche, les cellules qui ont été donnés une faible quantité de blessures d&#39;étirement produit LDH dans un montant similaire aux cellules témoins. Comme mentionné dans le protocole, il faut veiller à ce que la quantité appropriée de milieu est utilisé depuis une augmentation ou une diminution de la quantité de milieu peuvent entraîner des différences dans la pression maximale appliquée aux puits. Par exemple, un puits contenant 5 ml de liquide enregistre une pression maximale dans la moyenne de 4,0 psi pendant un puits vide enregistre une moyenne de 3,8 psi quand 45 psi pression est appliquée. Par conséquent, il est préférable de pousser plusieurs fois le déclenchement sur un contrôle et à veiller à ce que la pression maximale qui sera généré correspond à la quantité désirée. Dans nos expériences, nous avons utilisé une viabilité tache de déterminer l&#39;effet de l&#39;étirement de la perméabilité de la membrane cellulaire. L&#39;optique des plaques de culture souple à fond, nous avons utilisé nous permet de view Les cellules colorées directement sous le microscope. Toutefois, lorsque l&#39;on veut réaliser des études de immunomarquage directement après l&#39;étirement des blessures, des difficultés peuvent survenir. Tout d&#39;abord, la taille et l&#39;épaisseur de la plaque peuvent poser un problème avec certaines plateformes d&#39;observation au microscope. Deuxièmement, l&#39;optique de la membrane souple du puits peuvent être un obstacle à une visualisation claire. Malgré les limites mentionnées ci-dessus, cependant, la procédure décrite peut être utilisée comme un modèle d&#39;une blessure mécanique in vitro du Bureau. Une lésion cérébrale traumatique (TBI) comporte deux volets, à savoir, l&#39;ischémie et les traumatismes. L&#39;ischémie peut survenir à la suite de blessures secondaires TBI dans les cas où il ya perte de sang grave entraînant une pression artérielle basse ou à la suite d&#39;un oedème cérébral limitant l&#39;apport d&#39;oxygène au cerveau. Il est considéré comme un retard, des dommages non mécaniques représentant des processus pathologiques consécutifs lancés au moment de la blessure 25. La survenue d&#39;une hypoxieprès avoir grave lésion cérébrale traumatique est fréquente 26. la privation de glucose d&#39;oxygène (OGD) est la méthode actuellement utilisée pour modéliser l&#39;ischémie in vitro. Ainsi, en soumettant les cellules à OGD comme une insulte secondaire par rapport aux cellules après étirement peut imiter l&#39;incidence des TBI suivie par l&#39;ischémie. Ainsi, pour améliorer notre actuel modèle in vitro de TBI et le modèle le plus près possible d&#39;une réelle TBI comme cela se produit in vivo, dans l&#39;avenir, nous allons aussi utiliser OGD en combinaison avec des blessures d&#39;étirement.

Une lésion cérébrale traumatique (TBI) est l&#39;une des principales causes de décès dans le monde. Environ 10 millions de personnes sont touchées chaque année par TBI qui en fait un problème sanitaire et médicale 1. Pour cette raison, diverses in vivo et des modèles in vitro de TBI ont été mis en place et développé pour étudier les mécanismes 2,3,4. Une meilleure compréhension de TBI peut aider à améliorer le traitement des patients et de diminuer la mortalité, la morbidité et les coûts. De nombreux modèles de lésion cérébrale qui utilisent à la fois in vivo et in vitro méthodes existent. Dans les modèles in vivo pourrait imiter l&#39;événement réel de blessure à la tête. Toutefois, en raison de la complexité de la situation in vivo, l&#39;accessibilité au tissu d&#39;intérêt devient limité 2. Pour comprendre la réponse physiologique des cellules individuelles à la suite de la blessure infligée, il est important que les cellules sont isolées à partir des effets systémiques quipeuvent inhiber ou de modifier leur réponse individuelle 5. Pour cette raison, des modèles cellulaires de traumatisme offrent des avantages précieux sur des modèles animaux que l&#39;environnement mécanique des cellules peut être contrôlée avec précision 6. Dans les systèmes in vitro qui emploient l&#39;utilisation de charge mécanique de cellules ou de tissus afin de déterminer des altérations induites par un tel procédé de blessures ont été développés. Par exemple, une méthode pour étudier l&#39;effet des dommages mécaniques aux cellules a été établi pour les astrocytes, neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales aortiques 7,8,9. Le modèle de traumatisme vitro établi pour l&#39;étude des rongeurs et réactivité des astrocytes homme de 10 employés un dispositif de contrôle de pression identique à ce que nous utilisons pour notre modèle. La même méthode a été appliquée à induire des lésions par étirement dans les cellules du cerveau de souris microvaisseaux endothéliales (bEnd3) 11 et les neurones corticaux 12,13 ainsi que, endoth cérébraleElial cellules de porcelets nouveau-nés 14. Dispositif déforme le fond du puits de culture produisant de ce fait un dommage mécanique d&#39;étirement 10. Il inflige des blessures sur des cellules en culture par application d&#39;une pression d&#39;air au-dessus des cellules. Cette pression peut dévier la membrane sur laquelle les cellules sont de plus en plus, de ce fait l&#39;étirement des cellules. Divers degrés d&#39;étirement (c.-à «faible», modérée &quot;ou&quot; sévère &quot;) peuvent être obtenus en réglant la durée d&#39;impulsion de pression de l&#39;air et de l&#39;intensité en conséquence. Cette méthode de blessure tronçon induite a été corrélée à une blessure traumatique in vivo 7. Plus , cette méthode permet de blessures pour le contrôle précis de l&#39;environnement extracellulaire et peut facilement être reproduit. Bien qu&#39;une approche similaire a été utilisée pour de nombreux autres types de cellules du cerveau, y compris bEnd3, notre modèle est un avantage en ce qu&#39;elle rend l&#39;utilisation du cerveau des cellules endothéliales microvasculaires murins (CEND) générédans notre laboratoire. Cette lignée cellulaire est un modèle bien adapté de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Dans des cultures cellulaires in vitro utilisés comme modèles BBB doit posséder des caractéristiques qui leur permettraient de servir comme écran de perméabilité. Un critère important pour un modèle cellulaire in vitro pour être un prédicteur de la perméabilité de la BHE est qu&#39;il doit posséder l&#39;architecture des cellules physiologiquement réaliste 15. Même si les cellules bEnd3 afficher distinctif broche morphologie de type épidermoïde de la culture 16, ils présentent un comportement irrégulier morphogénétique in vitro où ils forment des cavités kystiques plutôt que sur les structures tubulaires réguliers en fibrine gels 17. En outre, lorsque les cellules ont été injectées à des souris embryonnaires et néonatale, ils induits tumeurs à croissance rapide mortelles pour les souris embryonnaires, mais pas chez les souris nouveau-nés et les jeunes. Il est donc suggéré qu&#39;un ou plusieurs processus qui régissent normale de croissance endothélial, la migration et la différenciation ont été modifiés ou éliminanted dans cette lignée cellulaire 18. D&#39;autre part, morphologiques, évaluation immunocytochimique des mesures de flux endothéliales et l&#39;expression du marqueur du Bureau, bioélectrique et paracellulaire démontrer que notre Bureau CEND modèle est en effet un modèle adapté du Bureau 19. endothélium du cerveau in vivo est caractérisé par une perméabilité extrêmement serré avec résistance électrique trans-endothéliale (TEER) allant de 2000-5000 Qcm2. Pour les études de cerveau propriétés de barrière aux microvasculature aux produits pharmaceutiques, restrictif paracellulaire et l&#39;étanchéité des cellules devraient être envisagées. Dans la plupart des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCEC), ce n&#39;est pas conservée comme les cellules présentent TEER allant de 50 à 100 Qcm2 20. Le cerveau endothéliale bEnd3 de lignée cellulaire immortalisée génère des valeurs de TEER de pas plus de 60 Qcm 2 15. En revanche différenciation des cellules CEND avec un milieu contenant du sérum réduit affichageTEER valeurs allant de 300 à 500 Qcm2 19,21. À ce jour, des modèles in vitro de blessures étirement dans les cellules endothéliales du cerveau cultivées sont rares. Par conséquent, un modèle in vitro pour un traumatisme à cause de blessures d&#39;étirement en utilisant des cellules endothéliales cérébrales culture qui agissent en tant que modèle de la BHE mai s&#39;avérer utile. Dans ce protocole, nous présentons un modèle in vitro qui pourraient imiter l&#39;impact réel que les cellules du cerveau, les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau spécifiquement du Bureau, reçoivent au cours de TBI. Le principal avantage de ce modèle est que le montant des dommages appliquée aux cellules ainsi que le milieu extracellulaire peut être facilement contrôlé de manière précise qui permet la reproductibilité facile de montage expérimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

En raison de l&#39;incident de mortalité provoquée par une lésion cérébrale traumatique (TBI), les méthodes qui permettraient de mieux appréhender les mécanismes sous-jacents impliqués dans celui-ci sont utiles pour le traitement. Il ya à la fois in vivo et des méthodes in vitro disponibles à cet effet. In vivo modèles peuvent simuler un traumatisme crânien réel tel qu&#39;il se présente au cours de TBI. Cependant, les techniques in vivo ne peuvent être exploités pour des études au niveau de la physiologie cellulaire. Par conséquent, les méthodes in vitro sont plus avantageux à cet effet, car ils fournissent un accès plus facile aux cellules et le milieu extracellulaire pour la manipulation. Notre protocole présente un modèle in vitro de TBI avec des blessures d&#39;étirement dans les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales en. Il utilise la pression appliquée sur les cellules cultivées dans des puits à fond souple. La pression appliquée peut être facilement contrôlé et peut produire des blessures allant de faible à sévère. Le murincerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) générés dans notre laboratoire est un modèle bien adapté pour la barrière hémato-encéphalique (BHE) offrant ainsi un avantage à d&#39;autres systèmes qui utilisent une technique similaire. En outre, en raison de la simplicité de la méthode, expérimentales set-ups sont facilement dupliqués. Ainsi, ce modèle peut être utilisé dans l&#39;étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans TBI au Bureau.

Les cellules cultivées sur du collagène I préencolle plaques de culture à fond de 6 puits flexibles (57,75 cm 2) ont été soumis à divers degrés de blessures d&#39;étirement en utilisant le dispositif tendeur de la cellule. Après la soumission des cellules à des blessures, ils ont été examinés au microscope pour les effets de la lésion induite par étirage à la morphologie des cellules. Il a été observé que plus grand degré d&#39;étirement est appliquée aux cellules un degré plus élevé de distorsion de la cellule pourrait également être observées (Figure 1). Comme le montre la figure 1A, les cellules témoins qui n&#39;étaient pas soumis à des blessures apparaissent des cellules endothéliales vasculaires cérébraux que de forme régulière (CEND) sans aucune indication de gonflement des cellules ou de distorsion. Quand blessure tronçon a été appliquée (figures 1B-D), la déformation a pu être observée au microscope optique. Après l&#39;étirement des cellules sévèrement avec un pic de pression entre 3.5-4.5 psi, les cellules CEND apparus nettement rétractés, gonflés et déformés avec pas<html> espaces intercellulaires capables. En outre, l&#39;absorption de la viabilité tache (concentration finale 100 nM) a aussi augmenté le degré de lésion d&#39;étirement a augmenté (figure 2). La viabilité colorer utilisé est un colorant imperméant aux cellules saines qui devient perméat lorsque l&#39;intégrité de la membrane plasmique des cellules est compromise. Le colorant a été exclue de la plupart des cellules de contrôle, par conséquent, seulement quelques-uns des cellules ont été colorées (figure 2A) par rapport aux cellules allongées (figures 2B-D). Plus cellules fluoresce vert avec un degré accru de blessures d&#39;étirement. Comme un marqueur biochimique de la blessure, la libération de lactate déshydrogénase (LDH) enzyme a également été examinée conformément aux instructions du fabricant. Figure 3 montre qu&#39;une blessure extensible cellulaire croissante provoquée augmentant la libération de LDH. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figure 1. Examen de la microscopie optique des cellules normales vs blessé. (A) monocouche de cellules confluentes non étiré normale istightly emballé et allongée. Lorsque les cellules ont été étirés en appliquant une impulsion de pression maximale de 1,8 à 2,0 psi (c.-bas stretch), ils apparaissent moins compacte, les espaces indiqués par des flèches (B). Lorsque les cellules ont été modérément blessés avec une impulsion de pression maximale 2,5-3,0, certains d&#39;entre eux semblaient gonflés et déformés (C). Les cellules deviennent rentrés avec le bout sévère de 3,5-4,5 psi, comme indiqué par la flèche (D). Un grossissement de 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. Fluorescence examen microscopique des cellules normales vs blessé cellules traitées avec la viabilité 2h tache après une blessure A: cellules non étirées contrôle BD: cellules allongées (B - faible, C - modéré, D - sévère).... Un grossissement de 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Figure 3. Déshydrogénase (LDH) libération de l&#39;enzyme lactate dans le surnageant après une blessure extensible. LDH libérée dans le milieu de culture a été mesurée à différents intervalles de temps après étirement blessure induite. LDH a été exprimée en pour cent de la LDH libérable totale (LDH dans les médias plus des cellules). Les valeurs sont ± SEM. Le n pour chaque point de temps est de 5, à l&#39;exception du 0 h Valeur soumis à un étirement sévère où n = 3. LDH par les cellules qui ont été soumis à un étirement faible et modérée ne diffère pas sensiblement de celle des témoins non étirées et de l&#39;autre. Les cellules qui ont été sévèrement tendues publié une quantité nettement plus importante de la LDH par rapport à tous les autres échantillons, à l&#39;exception de l&#39;échantillon modérément tendu à 1 h. (P &lt;0,05, un facteur ANOVA, méthode Holm-Sidak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . Tableau 1. Guide pour générer divers degrés de blessures étirement. <table border="1"><tbody><tr><th> La pression du régulateur </th><th> La pression maximale </th><th> Gravité des blessures </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1.2-1.5 psi </td><td> &lt;Low </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Faible </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2.5-3.0 psi </td><td> Modéré </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3.5-4.5 psi </td><td> Sévère </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8-6,0 psi </td><td> &gt; Severe </td></tr></tbody></table>

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro modèles de lésions cérébrales traumatiques sont développés pour reproduire la déformation du cerveau in vivo. Blessure Stretch-induite a été utilisée pour les astrocytes, neurones, cellules gliales, aortiques et des cellules endothéliales cérébrales. Toutefois, notre système utilise une barrière hémato-encéphalique (BHE) du modèle qui possède des propriétés constituant un modèle légitime du Bureau d&#39;établir un modèle de TBI in vitro.

Étirer dans le cerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) comme<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisme modèle du cerveau de la barrière hémato-encéphalique

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K vues.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  In vitro modèles de lésions cérébrales traumatiques sont développés pour reproduire la déformation du cerveau in vivo. Blessure Stretch-induite a été utilisée pour les astrocytes, neurones, cellules gliales, aortiques et des cellules endothéliales cérébrales. Toutefois, notre système utilise une barrière hémato-encéphalique (BHE) du modèle qui possède des propriétés constituant un modèle légitime du Bureau d'établir ...

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Guidée par IRM rupture de la barrière hémato-encéphalique en utilisant transcrânienne d&#39;ultrasons focalisés dans un modèle de rat

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Recherche

Médecine

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modèle Rat de rupture de la barrière hémato-encéphalique pour permettre ciblée Therapeutics neurovasculaire

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Contrôlée corticale modèle d&#39;impact pour Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Un modèle Roman de lésions cérébrales traumatiques légères pour les jeunes rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

Un modèle de souris de blessures cérébrales traumatiques légères et répétitives légères

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...