Les constructions optogénétiques livrées par voie virale permettent une caractérisation électrophysiologique détaillée de la physiologie et de la plasticité de synapses spécifiques dans les tranches cérébrales aiguës. Les principaux avantages de l’activation optogénétique des synapses sont la possibilité d’étudier les voies à longue distance et la stimulation sélective des axones qui ne sont pas anatomiquement séparés. La démonstration de la procédure sera effectuée par la Dre Lisa Kinnavane, associée de recherche de notre laboratoire.
Pour commencer, chargez une seringue Hamilton dans une pompe à seringue à microinjection fixée à un bras mobile monté sur un cadre stéréotaxique. Ensuite, placez une partie aliquote de cinq microlitres du virus dans une microcentrifugeuse. Faites tourner le tube pendant quelques secondes et pipeter deux microlitres de la préparation virale dans le couvercle du tube.
Pour remplir la seringue avec la préparation virale, visualisez la pointe de l’aiguille avec un microscope chirurgical. Ensuite, placez manuellement le bolus du virus à l’extrémité de l’aiguille et retirez le piston de la seringue à l’aide des commandes de la pompe. Réglez le volume d’injection de la pompe à 300 nanolitres et le débit à 100 nanolitres par minute.
Faites fonctionner la pompe et confirmez le bon débit en observant la gouttelette du virus à l’extrémité de l’aiguille. Absorbez le virus sur un coton-tige et nettoyez l’aiguille avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, à l’aide des vis de réglage sur le cadre stéréotaxique, naviguez la pointe de l’aiguille jusqu’au bregma et notez les mesures stéréotaxiques observées sur les trois échelles de vernier sur le cadre.
Additionnez ou soustrayez ces distances des coordonnées bregma. Faites un trou de bavure à la surface du crâne à l’aide d’une micro-perceuse montée sur le bras stéréotaxique. Insérez l’aiguille dans le cerveau à la coordonnée dorso-ventrale prédéterminée et perfuser un volume prédéterminé de la préparation virale.
Après la perfusion, laisser l’aiguille in situ pendant 10 minutes pour permettre la diffusion du bol. Ensuite, retirez l’aiguille et faites fonctionner la pompe pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bloquée. Deux semaines après l’injection virale, euthanasier le rat, disséquer rapidement tout le cerveau et le transférer dans la solution de coupe de saccharose.
À l’aide d’une cuillère à café en métal, ramassez le cerveau, jetez l’excès de solution et placez-le sur un papier filtre. À l’aide d’un scalpel, retirez le cervelet et coupez le cerveau dans le plan coronal environ à mi-chemin sur sa longueur. La moitié postérieure est le bloc tissulaire LEC.
Retournez le bloc tissulaire et le cerveau restant dans la solution de coupe de saccharose. Ensuite, placez une goutte de colle cyanoacrylate sur une scène de vibratome et étalez-la en une fine couche. Ensuite, à l’aide d’une cuillère à café, choisissez le bloc de tissu LEC et transférez-le sur le patch de colle, de sorte que la coupe coronale antérieure ait adhéré.
Installez la scène dans la chambre du tissu vibratome et versez rapidement suffisamment de solution de coupe de saccharose pour submerger le tissu. Après avoir orienté la surface ventrale du bloc tissulaire vers le limbe, coupez des tranches de 350 micromètres d’épaisseur du ventral au dorsal en utilisant une vitesse d’avancement lente de la lame. En règle générale, sept tranches peuvent être obtenues par hémisphère.
Transférer les tranches dans la chambre de collecte des tranches. Ensuite, placez la chambre de collecte dans un bain-marie de 34 degrés Celsius pendant une heure avant de revenir à température ambiante. Placez le reste du cerveau dans du paraformaldéhyde pendant 48 heures.
Pour l’identification de la cellule cible, placez la tranche dans la chambre d’enregistrement et immobilisez-la à l’aide d’une ancre de tranche. Sous un faible grossissement, à l’aide d’un éclairage infrarouge, naviguez jusqu’à la couche cinq LEC. Ensuite, passez à l’objectif d’immersion dans l’eau à fort grossissement et identifiez les neurones pyramidaux.
Marquez la position de la cellule sur le moniteur avec du ruban adhésif. Ensuite, pour former une pince patch à cellules entières, fabriquez une micro-pipette en verre borosilicaté et remplissez-la de solution d’enregistrement intracellulaire. Placez la micro-pipette remplie dans le porte-électrode et appliquez une pression positive en soufflant fort dans un embout buccal relié à l’orifice latéral du porte-électrode.
Soulevez l’objectif du microscope de telle sorte qu’un ménisque se forme et insérez l’électrode dans le ménisque jusqu’à ce qu’elle puisse être vue au microscope. Ouvrez la fenêtre Test d’étanchéité et déterminez si la résistance de la pipette est de trois à cinq mégaohms. Ensuite, touchez la cellule identifiée avec une pointe de pipette, ce qui entraîne une indentation dans la membrane cellulaire.
Ensuite, appliquez une pression négative par aspiration à l’embout buccal, ce qui augmente la résistance de la pipette. Continuez à appliquer une pression négative progressivement jusqu’à ce que la membrane cellulaire se rompe, ce qui entraîne des transitoires de capacité de la cellule entière. Pour entrer dans la configuration de pince actuelle, utilisez une LED montée dirigée dans le trajet de lumière du microscope avec des cubes de filtre et des optiques appropriées, et appliquez des impulsions lumineuses à la tranche via l’objectif 40X.
Délivrez des trains d’impulsions lumineuses multiples à cinq hertz, 10 hertz et 20 hertz pour étudier les propriétés de libération présynaptique. Pour permettre à la biocytine de remplir le neurone, attendez au moins 15 minutes après être entré dans la configuration de la cellule entière. Dans la pince de tension, surveillez la capacité de la membrane et la résistance d’entrée.
Ensuite, retirez lentement la pipette le long de l’angle d’approche loin du soma de la cellule, en observant la lente disparition des transitoires de capacité et du courant membranaire, indiquant le rebouchage de la membrane cellulaire et la formation d’une tache extérieure à l’extrémité de la pipette. Placez la tranche dans le paraformaldéhyde dans une assiette de 24 puits et incuber pendant la nuit. À l’aide d’un milieu OCT, fixer un bloc tissulaire au disque de l’échantillon du cryostat.
Pour congeler le tissu, placez l’isopentane dans un contenant approprié et immergez le disque de l’échantillon, en vous assurant que le tissu est au-dessus du niveau de l’isopentane. Ensuite, abaissez le récipient d’isopentane dans de l’azote liquide et laissez le tissu geler. Une fois que le tissu est complètement congelé, laissez le bloc tissulaire dans la chambre du cryostat à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre à la température du bloc de s’équilibrer.
Après l’équilibration, coupez des sections de 40 micromètres d’épaisseur dans le cryostat et utilisez un pinceau fin pour guider les sections hors de la lame. Collez ces sections congelées à une lame de microscope en verre revêtu de poly-L-lysine à température ambiante en touchant la lame aux sections. Après avoir ajouté 150 microlitres de support de montage à chaque glissière, appliquez le couvercle et retirez les bulles d’air en appuyant doucement sur le couvercle.
Couvrez les lames pour les protéger contre le photoblanchiment et laissez-les sécher à l’air libre pendant 12 heures. Ensuite, à l’aide d’un microscope à fluorescence, examinez l’emplacement du site d’injection virale. Pour la coloration à la biocytine, incuber les tranches dans du peroxyde d’hydrogène à 3% dans du PBS pendant 30 minutes pour bloquer toute activité endogène de la peroxydase.
Ensuite, lavez les tranches de cerveau avec du PBS jusqu’à ce qu’aucune autre bulle d’oxygène ne soit visible. Ensuite, incuber les tranches pendant trois heures dans une solution complexe HRP biotinylée à 1% d’avidine dans du PBS contenant 0,1% de Triton X-100. Après six lavages de PBS, incuber chaque tranche dans une solution de DAB jusqu’à ce que la coloration biocytine des structures neuronales devienne visible.
Arrêtez la réaction en transférant les tranches dans du PBS froid. Montez ensuite les tranches sur les lames de microscope en verre à l’aide d’un pinceau. Après avoir enlevé l’excès de PBS, ajoutez le support de montage.
Couvrez les tranches à l’aide de lamelles de couvercle et laissez-les sécher à l’air, comme démontré précédemment. Une cellule pyramidale saine a été localisée et rapiécée. Si l’identification post-synaptique de la cellule est requise, une cellule exprimant le marqueur fluorescent doit être localisée à l’aide d’une optique à grand champ.
Des impulsions lumineuses uniques de deux millisecondes ont donné lieu à des potentiels excitateurs post-synaptiques optogénétiques de forme d’onde simple. La plasticité à court terme de la synapse est examinée en appliquant des trains de stimulation lumineuse de cinq, 10 et 20 hertz. Tout en étudiant la plasticité à long terme, l’ajout de carbachol agoniste cholinergique au LCa circulant pendant 10 minutes a provoqué une dépression à long terme qui était encore évidente 40 minutes après le retrait du ligand.
La longueur du site d’injection a été examinée histologiquement. Le rapporteur fluorescent mCherry a été localisé dans les couches plus profondes du cortex prélimbique et infralimbique. De plus, la coloration d’une cellule remplie de biocytine a confirmé son emplacement et sa morphologie.
Les étapes critiques de ce protocole sont la transduction précise de la région cérébrale afférente, qui peut être vérifiée post hoc, et la dissection rapide du cerveau lors de la préparation de tranches aiguës. Cette procédure est facilement combinée avec le marquage fluorescent d’un type de cellule individuel, tel qu’une sous-classe d’interneurones particulière. Pour ce faire, nous utiliserions un animal transgénique qui exprime une recombinase dans ce type de cellule particulier.
Les constructions optogénétiques livrées par Virally ont permis des progrès rapides dans les domaines des systèmes et de la neuroscience des circuits.
