Le financement a été fourni par des subventions du NIH 5T32CA09216-26 (pour la JSB), et K01 AR055619-01A1 et 3 K01 AR055619-03S1 (pour DML), ainsi que par la Fondation Alex Lemonade Stand, le Harvard Stem Cell Institute et l&#39;American Cancer Société.

1. Microinjection d&#39;ADN des embryons de poissons zèbres <ol><li> Linéariser rag2:: cMyc et rag2: les constructions GFP DNA 11 en digérant 10 pg de chaque plasmide avec Notl à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Phénol: extrait de chloroforme et précipiter les plasmides, et remettre chacun à 20 pi H 2 O. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ADN en exécutant une dilution 1:1, 1:5 et 1:10 de chaque plasmide digéré sur un gel d&#39;agarose 1% avec 20 pi, 10 pi et d&#39;une échelle 5uL de l&#39;ADN de haute gamme. Ce type de quantification est généralement plus précis que d&#39;une lecture du spectromètre. </li><li> Diluer l&#39;ADN à une concentration finale de 1M KCl 60ng/μL de TE 0,5 X pour injection dans CG1-souche (ou d&#39;autres souches syngéniques) embryons de poissons zèbres utilisant 30ng/μL rag2:: cMyc + 30ng/μL rag2:: GFP. </li><li> Les injections doivent être effectuées que 12 précédemment démontré, 13. Brièvement, le poisson-zèbre mâle et femelle sont mis en place dans les chambres à l&#39;accouplement de la nuit avant l&#39;injection. Le jour de l&#39;injection, l&#39;ADN est chargé dans l&#39;aiguille d&#39;injection, la pression est ajustée de telle sorte que la bulle d&#39;un diamètre 50 microns est expulsé (30pg ADN), qui est mesurée par un micromètre. Puis, les embryons sont injectés au stade d&#39;une cellule, avec l&#39;ADN étant injecté directement dans la cellule, et non dans le jaune. La survie de la CG1 injecté embryons et des larves est généralement faible, et seulement 5% des poissons intégrer avec succès le transgène, ainsi,&gt; 600 embryons devraient être injectés pour garantir que certains poissons se développer une leucémie. </li><li> Stocker les embryons injectés à 28,5 ° C, et de supprimer les embryons morts après 24 heures. Les animaux sont ensuite transférés à de grands réservoirs à 5 jours de vie et a grandi comme décrit précédemment 14. </li></ol> 2. Le dépistage de T-ALL primaires chez les larves de poisson zèbre <ol><li> Environ 28 jours après l&#39;injection, anesthésier le poisson-zèbre larvaires en ajoutant 200 ul d&#39;4NG / m Tricane-S à 25 ml d&#39;eau du système de poissons dans une boîte de Pétri. </li><li> Examiner les larves pour le développement de fluorescence étiquetés T-ALL en utilisant un microscope à épifluorescence à un grossissement de 20x, avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation et d&#39;émission 485/20 530/25 filtre pour détecter la fluorescence GFP (figure 1). </li><li> Séparée larves tumorales positives de celles qui sont négatives. Larves négatives peuvent être examinées à un stade ultérieur, une fois les tumeurs peuvent avoir grandi, pour s&#39;assurer que pas de T-ALL poissons positifs ont été manquées. </li><li> Moniteur T-ALL poissons positifs au moins une fois à la semaine en utilisant le microscope à épifluorescence pour suivre la croissance tumorale. </li></ol> 3. L&#39;isolement et la purification de l&#39;marqués à la fluorescence des cellules leucémiques primaires <ol><li> Lorsque les cellules leucémiques GFP-positives ont dépassé&gt; 50% de l&#39;animal, le sacrifice du poisson en ajoutant 1 ml de 4ng/mL Tricane-S dans une boîte de Pétri contenant 9 ml d&#39;eau du système de poisson. </li><li> Placer le poisson dans un plat de Pétri contenant de nouvelles 1ml 0.9x PBS avec 5% de sérum bovin fœtal à amortir les cellules. Faire macérer les poissons avec une lame de rasoir, une pipette le mélange de dissocier touffes à grandes cellules, puis passer les cellules à travers un tamis 40μm dans un tube de 50ml. Il n&#39;est pas nécessaire de dissocier les amas de tissu dans des cellules individuelles. </li><li> 500μL Pipet des cellules dans un tube de polystyrène 4mL. Ajouter 1 microlitre 1mg/mL iodure de propidium (PI), qui sera l&#39;étiquette cellules mortes. Vortex, puis maintenir les cellules sur la glace. </li><li> Sacrifiez un type sauvage CG1 poisson, laisser macérer et de la souche de la même manière que ci-dessus pour collecter les cellules normales, qui servent de support pour les cellules tumorales au cours transplant.Add 4mL 5% FBS dans 0.9x PBS pour le tube de 50 ml pour un total volume de 5 mL. </li><li> Compter les cellules normales, diluer à 3x10 5 cellules / mL dans 5% de FBS en 0.9x PBS, puis 100μL/well pipette d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> En utilisant un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS), trier GFP-positives, PI cellules tumorales négatives (figure 2A, B) dans la plaque de 96 puits contenant les cellules sanguines aux doses suivantes: 10 cellules / puits dans 48 puits, 100 cellules / puits dans 24 puits, 1000 cellules / puits dans 12 puits et 10 000 cellules / puits dans 6 puits. De plus, 10 000 cellules doivent être triés dans un puits sans cellules sanguines normales, et retestés utilisant FACS pour évaluer la pureté et la viabilité des cellules triées (figure 2C). </li></ol> 4. Limiter la transplantation de dilution dans le poisson-zèbre pour adultes <ol><li> Pellet les cellules par centrifugation de la plaque de 96 puits à 2000xg pendant 10 minutes. </li><li> Retirer 95μL de surnageant et remettre en suspension les cellules dans le 5uL restantes. </li><li> Tenir un adulte (&gt; 60 jours) syngéniques secondaires zebrafish ventrale en place, et injecter la suspension de cellules dans la cavité péritonéale, en utilisant un 26G / 2 &quot;micro-seringue. Zebrafish n&#39;ont pas à être anesthésiés avant la greffe. Typiquement, 45 poissons sont transplantés avec 10 cellules de leucémie, 20 sont transplantés avec 100 cellules, 7 sont transplantés avec 1.000 cellules et 5 poissons sont transplantés avec 10.000 T-toutes les cellules. </li></ol> 5. Analyse pour déterminer la leucémie-initier la fréquence de cellules <ol><li> Environ 28 jours après la transplantation, examiner le poisson transplanté avec un microscope à l&#39;aide d&#39;un epifluoresence onde d&#39;excitation et d&#39;émission 485/20 530/25 filtre pour détecter la fluorescence GFP. Notez le nombre de poissons positifs par rapport au nombre total de poissons injectés. </li><li> Re-examiner le poisson tous les 14 jours pour un maximum de 90 jours et d&#39;enregistrer le nombre de poissons positif. Quand un poisson tumeurs positives devenue moribonde, le sacrifice de l&#39;animal par Tricane-S surdosage. </li><li> Entrée des résultats dans un tableau, comme dans la figure 3D. Charger les données dans le ELDA basé sur le Web (Extreme Analyse de dilution limite) des logiciels statistiques au <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15, qui utilise la fréquence des tumeurs des animaux positifs et négatifs à chaque dose de greffe afin de déterminer la fréquence de l&#39;auto-renouvellement des cellules leucémiques primaires au sein du T-ALL. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Microinjection d&#39;ADN dans des embryons de poissons syngéniques traduit souvent par un faible taux de survie des embryons injectés, avec &lt;60% des embryons survivent pendant 24 heures. De plus, la survie des poissons injectés syngéniques est généralement faible durant le développement larvaire, avec souvent &lt;20% survivent pendant 28 jours. Il est donc important d&#39;injecter un grand nombre d&#39;embryons en vue de créer les poissons transgéniques qui développent T-ALL. À titre d&#39;exemple, CG1 embryons souche ont été injectés avec rag2:: cMyc + rag2:: GFP. Les transgènes co-ségrégation dans l&#39;embryon en développement, afin que chaque cellule qui exprime la GFP sera également exprimer cMyc. Les larves ont été projetés pour le primaire T-ALL après 28 jours (figure 1). Des travaux antérieurs ont montré que 5% environ des poissons injectés auront GFP-positives cellules T dans leur thymus (figure 1), et 100% de ces poissons se développer une leucémie que les T-cellules deviennent 11 transformé. Bien qu&#39;une faible proportion de poisson zèbre peut avoir une leucémie plus avancé qui est très facile à détecter à jour 28, la plupart n&#39;auront qu&#39;un GFP-positives du thymus (figure 1), donc les larves doivent être examinés individuellement sous fort grossissement pour s&#39;assurer que tous positifs poissons sont sélectionnés. GFP-positives T-ALL cellules dépassera&gt; 50% de l&#39;animal entre les jours de 45 à 70. Dans l&#39;exemple fourni, le poisson zèbre ont été sacrifiés à 65 jours de vie, et les cellules leucémiques ont été isolées et FACS triés pour limiter la transplantation de dilution. Les cellules individuelles qui ont été négatifs iodure de propidium et GFP-positives (figure 2) ont été triés dans une plaque de 96 puits. Réanalyse a été effectué sur 10 000 cellules triées afin d&#39;évaluer la viabilité (idéalement&gt; 95%) et la pureté (idéalement&gt; 92%, figure 2). Transplantés T-ALLS résultent généralement avant 28 jours, mais certaines tumeurs peuvent prendre plus de 60 jours pour se développer. Dans cet exemple, au 28ème jour, les tumeurs stade précoce ont été considérées comme un domaine de la GFP de cellules positives à proximité du site d&#39;injection (figure 3B), tandis que certains ALLS T-étaient plus progressé, ayant élargi pour remplir la cavité péritonéale (figure 3C) . Les données provenant des essais de dilution en limitant la transplantation de cellules primaires à partir de trois différents T-Alls sont présentés dans la figure 3D. Pour ces expériences, plus de 220 animaux ont été transplantés, qui peut être facilement accompli par une personne au sein de plusieurs heures. L&#39;analyse des données en utilisant le logiciel ELDA a montré que, en moyenne, 1 à 135 T-ALL cellules ont été auto-renouvellement des cellules leucémiques se propageant (figure 3F). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1 larves de poisson zèbre injectés au stade d&#39;une cellule avec un chiffon.::-CMyc + chiffon::-eGFP ont été testés pour la croissance de leucémie primaire 28 jours après l&#39;injection. Poisson (*) avait GFP-positives cellules T dans le thymus, ce poisson se développera T-ALL comme les lymphocytes T se transforment au fil du temps. Cette étape est très commun au 28ème jour. Un poisson (**) avait une pointe T-ALL qui s&#39;est propagé dans les tissus mous. Les deux autres poissons sont négatifs pour la croissance tumorale. L&#39;image a été prise à un grossissement de 16X. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Marqués à la fluorescence T-ALL cellules ont été triées à partir d&#39;animaux malades et utilisé dans le dosage de transplantation de cellules de dilution limite. Tout d&#39;abord, un portail a été élaboré pour sélectionner des cellules individuelles (panneau supérieur gauche), puis l&#39;iodure de propidium cellules négatives sont sélectionnés (au milieu à gauche). Enfin, une porte a été élaboré pour sélectionner uniquement les GFP-positives pour le tri des cellules leucémiques (panneau inférieur gauche). Tri des cellules doit être réanalysé pour évaluer la viabilité et la pureté avant la greffe (panneaux de droite). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Zebrafish ont été examinés pour la croissance de leucémie 28 jours après la transplantation. Les poissons sont soit des tumeurs négATIFS (A), ont une petite tumeur croissante au site d&#39;injection (B), ou avoir une leucémie progressé (C). Les images ont été prises à un grossissement de 7X. Le nombre total de leucémie positif poissons par nombre total de poissons transplantés à chaque dilution est enregistré, comme dans (D). Les données sont entrées dans le programme basé sur le Web ELDA pour calculer le nombre d&#39;auto-renouvellement des cellules de leucémie et le 95 supérieures et inférieures des intervalles de confiance% (E).

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Une des grandes forces de l&#39;utilisation de poissons zèbres de recherche sur le cancer est qu&#39;un grand nombre d&#39;animaux peut être utilisé à un coût relativement faible. Ceci est particulièrement important dans la limitation des essais de dilution transplantation de cellules, où les proportions d&#39;animaux transplantés qui développent des tumeurs au nombre total transplantés sont utilisés pour déterminer la fréquence des tumeurs initier cellule. Dans la méthode présentée ici, plus de 70 animaux receveurs de greffe sont utilisés par test, en fournissant une estimation précise du nombre de cellules de tumeur se propage. Tant le nombre d&#39;animaux utilisés et les doses de cellules tumorales transplantées devraient être optimisés pour un modèle de cancer donné, par exemple, si les premières expériences montrent la tumeur initier les cellules sont rares, les doses peuvent être utiles greffe 100000, 50000, 10000 et 1000 cellules par transplantation. Syngéniques souches de poisson zèbre sont utiles dans l&#39;analyse de limiter la dilution. Cependant, ces souches ne sont pas encore couramment utilisés dans tous les laboratoires, et certains modèles de cancer zebrafish existent seulement dans les poissons allogènes. Limiter les transplantations de cellules de dilution peut être effectuée dans des souches sauvages qui ont subi l&#39;ablation immunitaire, bien que la fréquence des cellules auto-renouvellement peut être calculé comme 10 à 100 fois plus élevée que si le poisson-zèbre syngéniques ont été utilisés 8. Il est important de noter que des doses de cellules doivent être utilisés pour des transplantations en non-immunes appariés, les destinataires irradiés, comme certaines cellules tumorales ne survivra pas transplanter dans un microenvironnement étrangers. De plus, de nombreuses tumeurs ne commencent à régresser après 21 jours lorsque le système immunitaire de l&#39;animal receveur récupère donc les animaux doivent être évalués pour la croissance tumorale tous les 7 jours après la greffe. Les méthodes présentées ici sont adaptés pour une utilisation avec n&#39;importe quel modèle de cancer du poisson zèbre, et ont jusqu&#39;à présent été utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules initier à la fois dans des cellules T leucémie aiguë lymphoblastique 8, et un modèle de tumeur solide, le rhabdomyosarcome 16. Ces tumeurs ont été marqués par fluorescence par co-injection d&#39;embryons à la fois avec un oncogène et de marqueur fluorescent; car l&#39;ADN co-ségrégation, toute cellule exprimant l&#39;oncogène également exprimer la protéine fluorescente 17. Alors que la fluorescence est recommandée car elle facilite le suivi de la croissance tumorale, sans la nécessité de sacrifier l&#39;animal et fournit un moyen straight-forward pour isoler les cellules tumorales par FACS, il est possible d&#39;étiqueter les cellules tumorales avec des anticorps spécifiques de la tumeur décideurs pour faciliter leur purification , coloration des anticorps bien chez le poisson zèbre peut exiger d&#39;optimisation. Enfin, une fois l&#39;incidence des tumeurs propageant cellules a été déterminée pour un type de tumeur donné, il est possible d&#39;utiliser ces tests pour identifier les mécanismes qui régissent leur fréquence cellulaire. Par exemple, les cellules tumorales primaires peuvent être traités par des inhibiteurs spécifiques voie avant de limiter la dilution de greffe, ou des poissons transplantés eux-mêmes peuvent être dosés avec des médicaments. De plus, la génétique des tumeurs elles-mêmes peuvent être manipulées par l&#39;injection des poissons stade unicellulaire avec un gène d&#39;intérêt, alors que les tumeurs primaires résultant seront sur-expriment le gène. Dans ces expériences, aucun effet sur l&#39;auto-renouvellement des cellules de fréquence sera observée dans les essais de dilution limite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Le nom du réactif </th><th> Société </th><th> Nombre de catalogue </th></tr><tr><td> Enzyme de restriction NotI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Phénol: chloroforme </td><td> Biochimiques EMD </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> KCl 5M </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> Haute Gamme échelle d&#39;ADN </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Syngéniques zebrafish </td><td></td><td> Références 6-8 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> L&#39;iodure de propidium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Microseringue </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> Tamis 40μm maille </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

Cellules cancéreuses d&#39;auto-renouvellement sont les types de cellules que dans une tumeur qui ont une capacité illimitée de favoriser la croissance tumorale, et sont donc connus que la tumeur se propageant, ou des cellules tumorales initiatrices. On pense que le ciblage de ces cellules auto-renouvellement pour la destruction va bloquer la progression tumorale et l&#39;arrêt des rechutes, améliorant considérablement le pronostic du patient 1. La façon la plus courante pour déterminer la fréquence de l&#39;auto-renouvellement des cellules dans une tumeur est un test de dilution limite transplantation de cellules, dans lesquelles les cellules tumorales sont transplantés dans des animaux receveurs à des doses croissantes, la proportion d&#39;animaux qui développent des tumeurs est utilisée, le calcul du nombre d&#39;auto-renouvellement des cellules au sein de l&#39;échantillon de tumeur d&#39;origine 2, 3. Idéalement, un grand nombre d&#39;animaux seraient utilisés dans chaque expérience de dilution limite pour déterminer avec précision la fréquence des tumeurs des cellules propager. Cependant, des expériences à grande échelle impliquant des souris sont coûteuses, et la plupart des dosages de dilution limite l&#39;utilisation seulement 10-15 souris par expérience. Le poisson zèbre ont gagné en importance en tant que modèle de cancer, en grande partie à cause de leur facilité de manipulation génétique et de l&#39;économie par des expériences à grande échelle qui peuvent être effectuées. En outre, les types de cancer chez le poisson zèbre modélisés ont été trouvés à l&#39;imitent leurs 4 maladies homologue humain. Bien qu&#39;il soit possible de transplanter des cellules tumorales d&#39;un poisson à un autre en sous-létales d&#39;irradiation des animaux destinataire, la régénération du système immunitaire après 21 jours provoque souvent une régression tumorale 5. La création récente de poisson zèbre syngéniques a grandement facilité les études de transplantation de tumeurs 6-8. Parce que ces animaux sont génétiquement identiques, les cellules tumorales transplantées se greffer robuste en poissons du destinataire, et la croissance tumorale peut être surveillé sur de longues périodes de temps. Syngéniques zebrafish sont idéales pour limiter la dilution dans la transplantation des essais que les cellules tumorales n&#39;ont pas à s&#39;adapter à la croissance dans un microenvironnement étrangers, ce qui peut sous-estimer la fréquence des cellules auto-renouvellement 9, 10. En outre, une transplantation de cellules ont été réalisés avec succès en utilisant le poisson zèbre syngéniques 8 et plusieurs centaines d&#39;animaux peuvent être facilement et économiquement transplanté à un moment, qui tous deux servent à fournir une estimation plus précise de l&#39;auto-renouvellement de fréquence cellulaire. Ici, une méthode est présentée pour la création de primaire, marqués à la fluorescence des cellules T de leucémie aiguë lymphoblastique (T-ALL) chez le poisson zèbre syngéniques, et la transplantation de ces tumeurs à limiter la dilution dans les poissons adultes pour déterminer la fréquence des cellules auto-renouvellement. Alors que la leucémie est fourni à titre d&#39;exemple, ce protocole est adapté pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propageant en utilisant n&#39;importe quel modèle de cancer chez le poisson zèbre.

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Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Limitation des dosages de dilution transplantation de cellules sont utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propager. Ce protocole décrit une méthode pour générer le poisson-zèbre syngéniques qui développent une leucémie marqués à la fluorescence et les détails la façon d&#39;isoler et de transplanter ces cellules leucémiques à limiter la dilution dans la cavité péritonéale du poisson zèbre adulte.

Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

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Biology

19.1K vues.  Harvard Medical School. Limitation des dosages de dilution transplantation de cellules sont utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propager. Ce protocole décrit une méthode pour générer le poisson-zèbre syngéniques qui développent une leucémie marqués à la fluorescence et les détails la façon d'isoler et de transplanter ces cellules leucémiques à limiter la dilution dans la cavité péritonéale du poisson zèbre adulte.

Vidéo: Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

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Biologie

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Trachéotomie: Une méthode pour la transplantation de cellules souches pour le poumon

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l&#39;analyse de mutants Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...