我々は、フィールドでの援助に対して、L.エヴァンス、B.グレンジャー、D. Rissling、Z.シム、A.グッドウィン、K.ヘイハーストとD.カッチに感謝します。 K.ガルブレスは親切ベラクーラ谷からナキウサギの肝臓サンプルを提供した。この非侵襲的遺伝子サンプリング法の設計に貢献して興味深い議論のためのA.ゴンダシルバとK.ラーセンのおかげ。この作品は、MARに自然カナダディスカバリーの科学と工学研究評議会、およびUBCオカナガン個々の研究補助金によって賄われていた。スイス国立科学財団博士フェローシップPBSKP3_128523サポートされているPH。この研究は、ブリティッシュコロンビア大学（：A07 - 0126証明書の番号）からの動物のケアのプロトコールに従って実施した。

1。髪のスネアスネアを設定する前に、理想的な場所は、ナキウサギの生息地や崖錐斜面内で決定する必要があります。これは、植生、動物、夏の終わりに収集したキャッシュだけでなく、便所のサイトで見つけた新鮮scatsな干し草の山を、含まれています。パッキングテープ（長さが10 50CM）​​のストリップは360 °粘着性表面を提供するためにロールアップされており、エンベロープナキウサギの干し草の山（図1）やトイレのサイトへの入り口をへのWebのような方法で配置されています。岩の構成に応じて、釣り糸の一部は、（直径&lt;30センチメートル）の使用の完全な説明を髪のスネアの構造をサポートするために使用されますが、入り口がかなり小さいとき、これは、ほとんどその必要はありませんすることができます釣り糸は、ヘンリーとRussello（2010）3で見つけることができます。髪のスネアが可能、と毛髪ほど頻繁にチェックされ、収集とラベル付けされています（図2）テープ上に堆積。研究室に戻ったような一度、毛は、滅菌ピンセットを用いて粘着テープから削除され、極低温のチューブに移し、さらに操作まで-20℃で保存されています。独立してクラスタ化されたサンプルは別の個人に属すると仮定している間毛のスネアに沿って一緒にクラスタ化された毛髪サンプルは、単一の個体に属すると考えられている。後者のケースでは、毛は、その後別のチューブに配置されます。これらの仮定は、後のマイクロサテライト遺伝子型のデータに基づいて、DNAの指紋とアイデンティティの確率の計算の方法によって試験することができる。 2。 DNAの抽出ナキウサギの毛は非常に薄いものと小さなルートの電球を含んでいるので、我々は以前に25毛の最小値が良い品質のダウンストリームのPCR増幅3用のDNAの十分な量を得るために必要とされることが示されている。我々はDNA IQシステム（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン、米国）と毛髪のサンプルからのDNA単離のための製造業者の指示を少し変更したバージョンを使用する。まず、毛のサンプルはチューブを開いている間に髪の損失を避けるために、マイクロ遠心機でスピンダウンしています。その後、インキュベーション溶液は、プロテイナーゼKのインキュベーションの0.1 M DTTと1.8ng/mlの最終濃度につながることDTTの10μlの（1M）およびプロテイナーゼK（18ng/ml）の10μlをしてインキュベーション溶液80μlを混合して調製され溶液（100μl）を試料に添加し、℃で1時間56でインキュベートする。その間に、溶解液は、0.01Mの最終DTTの濃度で、その結果、溶解バッファーのすべての100μlのためにDTT（1M）を1μl添加して調製される。準備された溶解液（200μl）をその後、DNA IQ樹脂の7μlのと一緒に、サンプルに加え、高い速度で3秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。次いで、試料を2秒間ボルテックスし、溶液から磁気ビーズの分離が発生する磁気スタンドに挿入されます。残りの溶液は、次いで、磁性樹脂のペレットを乱さないように注意しながら、吸引し、廃棄されます。サンプルは、その後、準備溶解液100μlで処理ボルテックスし、分離が再び発生する磁気スタンドに戻されます。溶解緩衝液を吸引し、廃棄され、このステップは、洗浄緩衝液（100μl）を使用して3回繰り返されるている。サンプルは、その後15分間マグネチックスタンドで乾燥するために残されている。一度乾燥、溶出バッファー100μlをサンプルに追加され、℃で5分間65℃でインキュベートした。サンプルをボルテックスし、マグネットスタンドに挿入されます。今溶出したDNAを含む溶液は、次いで、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに移し、さらなる操作まで-20℃で保存されます。肝臓サンプルからのDNAは、DNAのIQシステムを利用して抽出し、PCR増幅のためのポジティブコントロールとして使用した。 3。 PCRの増幅私たちの非侵襲的な髪のスネアと肝臓サンプルから得られたDNAを、一般的に使用される分子マーカー（マイクロサテライト、AFLP、ミトコンドリアのチトクロームBとZFX / ZFY性判別のマーカー）のスイートを増幅した。 PCRは含む25μLボリュームでVeritiサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った：10 - 20 ngのDNAを、各プライマー0.5μM、10mMトリス- HCl（pH8.3）を、50mMののKCl、1.5mMのMgCl 2、200μMのdNTPを、10μウシ血清アルブミン（BSA;ニューイングランドバイオラボ、イプスウィッチ、MA、米国）、0.5 UのAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ社）。マイクロサテライト遺伝子座のためのサイクリングパラメータはタッチダウンサイクルプログラムを（95時10分使用して最適化を行った° C、95℃30秒C、30秒のアニーリングでは35サイクル、そして72℃で45秒° C、72最後のステップに続いて℃で10分間）。アニーリング温度は29、残りのサイクルは55℃を続け、その時点で6サイクル目、℃に達するまで° Cサイクルあたり60から55に1ずつ° Cの減少ミトコンドリアの断片のためのサイクリングパラメータは上記のように説明するが、アニーリングを35サイクルで構成されていた50℃の温度増幅断片長多型は、小笠原4で説明した脊椎動物のゲノムのためのプロトコールに従って実施されました。最後に、分子性判別は、HinfIを制限酵素消化5でZFX / ZFY遺伝子座のPCR - RFLPを用いて行われた。消化ZFX / ZFX断片が含まれている3％アガロースゲル上で100 bpのラダー（New England Biolabs社）と一緒に実行している間マイクロサテライト、AFLPsとチトクロームBのシーケンスからのPCR産物は、ABI 3130XL遺伝子アナライザー（アプライドバイオシステム社）に実行されました2.5％のSYBR Safe DNAゲル染色（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）とRED個人的なゲルイメージングシステム（アルファイノテック、サンリアンドロ、カリフォルニア州、米国）を用いて可視化。マイクロサテライトとAFLPsはGenemapper V3.7を使用して可視化した（Applied Biosystems社）およびミトコンドリアDNAのクロマトグラムは、Sequencher v4.7（ジーンコード（株）、アンハーバー、ミシガン、米国）を用いて可視化した。 4。代表的な結果私たちの非侵襲的なスネアを用いて得られた毛髪サンプルから抽出したDNAは、分子マーカーの様々な種類をPCR増幅した。比較の基準として、DNAは肝臓のサンプルを使用して抽出私たちの毛髪サンプルと一緒に増幅した。核マイクロサテライト遺伝子座が正常に髪と肝臓試料（図3）の両方で増幅された。肝臓のサンプルを使用する際、信号の強度が大きいが、これは遺伝子型のスコアリング（図3）に悪影響を持っていませんでした。 AFLPs（図4）、ミトコンドリアDNA配列（図5）、およびZFX / ZFY分子性判別のマーカー（図6）を使用する場合にも、同様の結果が得られました。 <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="図1"/> 図1非侵襲性の毛のスネアの例は、干し草の山に設置。明確なパッキングテープをロールアップさのストリップは、干し草の山への入り口を囲むようにウェブのような形式で配置されています。釣り糸の部分は毛のスネア用の追加サポートを提供するために使用されています。 <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。パッキングテープに付着した毛の多数を含む成功した毛髪スネア。 <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="図3"/> 図3代表的な核マイクロサテライトのクロマトグラム（Ocp6）8としてGenemapper V3.7（Applied Biosystems社）で表示されます。上部クロマトグラムは、肝臓の組織からDNAを増幅することによって得、そしてこの遺伝子座で（358分の354）ヘテロ接合体であるれました。下のクロマトグラムは、髪の毛から抽出したDNAに基づいて、ヘテロ接合体遺伝子型（362分の358）を示す別の個々を表しています。髪のサンプルからのクロマトグラムのシグナルが肝臓のサンプルよりも低い強度を持っているが、遺伝子型スコアに悪影響を信号でこの違いによる影響を受けません。 <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="図4"/> 図4のようなGenemapper V3.7（Applied Biosystems社）で表示される代表的なAFLPのクロマトグラム（E31T32）。上部クロマトグラムは、肝臓の組織からDNAを増幅することによって得られた、下のクロマトグラムは、髪の毛から抽出したDNAを表します。 <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。としてSequencher v4.7（遺伝子コード株式会社）に表示されている代表的なミトコンドリアDNA配列のクロマトグラム（チトクロームB）。上部クロマトグラムは、肝臓の組織からDNAを増幅することによって得られた、下のクロマトグラムは、髪の毛から抽出したDNAを表します。 <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。肝臓や毛髪サンプルの両方で増幅された代表的な分子性判別のマーカー（ZFX / ZFY）。このアプローチは、Y染色体はX染色体が欠けているこの地域でHinfI制限部位を有していることを観察に依存しています。男性は432 bpの、261 bpおよび171 bpの断片を生成しながらこのように、女性は432 bpの2人の共同の移行のフラグメントを生成する。

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	<li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population.">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li><li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size,+natal+philopatry,+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+(Aquila+heliaca)+in+central+Asia.">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li><li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger.">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li><li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares.">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li><li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+(AFLP)+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395.">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li><li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+European+rabbits+(Oryctolagus+cuniculus),+European+brown+hares+(Lepus+europaeus)+and+mountain+hares+(Lepus+timidus)+with+ZFX+and+ZFY+loci.">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li><li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species.">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li><li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demographic+monitoring+of+an+entire+species+(the+northern+hairy-nosed+wombat,+Lasiorhinus+krefftii)+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material.">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li><li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails.">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li><li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika,+Ochotona+princeps.">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

非侵襲的な遺伝的サンプリングは、いくつかの理由で、従来のライブトラッピング法に魅力的な代替となっています。最初に、控えめに野生集団から生物学的材料を（例えば、糞、毛、羽、唾液と粘液）収集することによって、研究者は、このように動物や研究者の両方にリスクを低減、処理、あるいはそれらを観察し、妨害することなく、これらの種を調べることができます。第二に、非侵襲的な遺伝的サンプリングは、より伝統的なライブ捕捉アプローチ6に困難なことができるタスクをとらえどころのない、希少種の個体群を研究する生物学者が可能になります。そして第三に、NGSは潜在的にこのように人口のパラメータ7の推定値にバイアスを最小限に抑え、動物、サンプリング活動、およびコストへの影響を減らすことによって、サンプルサイズを増やすことができます。絶滅危惧種を扱う場合は、この後者の点は、人口のパラメータの偏った推定値が不適切な管理につながる可能性があるため、決定的な証明されるかもしれない。 現在のビデオの記事では例としてアメリカのピカを使用して、とらえどころのない小さな哺乳類をサンプリングするために、シンプルで斬新な、安価で非侵襲的方法を説明します。我々は毛から抽出されたDNAはこの非侵襲的サンプリング法トラッピングまたは致命的なサンプリングを生きる魅力的な代替化、マイクロサテライト、AFLP、ミトコンドリアおよび性判別マーカーを基準にして肝臓サンプルから抽出したDNAと同様に行う実証する。全体的に、我々は研究対象の生物への影響を最小限に抑えながら、このメソッドは、珍しいかとらえどころのない小型の哺乳類の種の集団遺伝学的および行動学のデータ収集の段階で有用であることを期待しています。

髪のスネア： <ul><li>透明なパッキングテープのロール（3M、セントポール、ミネソタ州、米国） </li><li>釣り糸（10ポンド） </li><li>極低温のチューブ（2ミリリットル） </li><li>滅菌ピンセット</li><li>液体窒素デュワー（オプション） </li></ul> DNAの抽出： <ul><li>組織とヘア抽出キット（; Promega社カタログ番号DC6740）と、DNA IQシステム（Promega社カタログ番号DC6701）。 </li><li> MagneSphere技術磁気分離スタンド（カタログ番号Z5342、プロメガ社製） </li><li>マイクロ遠心機</li><li>ハイブリダイゼーションオーブンまたは水浴</li><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ</li></ul>

a noninvasive hair sampling technique to obtain high quality dna from elusive small mammals

非侵襲的な遺伝的サンプリングの手法は、野生生物の個体群を研究する重要性を増してきています。多くの研究は、集団遺伝学と野生の個体群1の人口統計を調査するために非侵襲的サンプリングの手法を用いて報告している。このアプローチは、珍しいかとらえどころのない種2で扱う場合に特に有用であることが証明されている。これらのメソッドの数が肉食動物と中型哺乳類からサンプルの毛、糞やその他の生物材料に開発されているが、彼らは主にとらえどころのない小型哺乳類でテストされていないままである。このビデオでは、我々は小説、とらえどころのない小さな哺乳類、アメリカのナキウサギ（Ochotona族長 ）を対象に、安価で非侵襲的な髪のスネアを提示する。我々は、梱包テープウェブのような形式で配置し、ナキウサギの生息地内のルートを走行に沿って配置のストリップで構成される毛のスネア、の一般的なアップセットを説明します。私たちは、その後、収集されると研究室に持ち帰ったことができる毛の大量の収集でスネアの効率を示しています。私たちは、その後、DNAを分離し、核のマイクロサテライトを含む、一般的に使用される分子マーカーを増幅するためにこの方法の有用性を紹介するためにDNA IQシステム（Promega社）を使用し、増幅断片長多型（AFLPs）、ミトコンドリアの配列（800bp）と同様に示す分子性判別マーカー。全体的に、我々は、野生生物の個体群の生物学者のためのサンプリング手法としてこの新たな非侵襲的な毛のスネアの有用性を実証する。我々は、このアプローチは、研究の生物への影響を最小限に抑えながら、自然集団内での調査の領域を開放、小型哺乳類のさまざまな適用されることを期待しています。

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

アメリカのナキウサギのために示されるように我々は、効率的にとらえどころのない小さな哺乳類から毛髪サンプルを収集するために非侵襲的サンプリングの手法を提示する。我々は、サンプリングされた髪の毛からDNAを抽出し、一般的に野生動物の生態と保全の研究で使用されている分子マーカーのいくつかのタイプを増幅することによってこの方法の有用性を実証する。

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

a-noninvasive-hair-sampling-technique-to-obtain-high-quality-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K ビュー.  University of British Columbia, Okanagan Campus. アメリカのナキウサギのために示されるように我々は、効率的にとらえどころのない小さな哺乳類から毛髪サンプルを収集するために非侵襲的サンプリングの手法を提示する。我々は、サンプリングされた髪の毛からDNAを抽出し、一般的に野生動物の生態と保全の研究で使用されている分子マーカーのいくつかのタイプを増幅することによってこの方法?...

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

生物学

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

非侵襲的インビボでの小動物MRIとMRS：基本的な実験手順

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

バイオマットから高分子量DNAの抽出

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

グレースケール解析を用いたマウスの抜け毛の定量分析のための新たな手法

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological information. The pathways generated by this online application are machine-readable and fully compatible with essentially all web-browsers and computer operating systems. It uses a specially developed, web-enabled pathway drawing interface that permits the selection and placement of different combinations of pre-drawn biological or biochemical entities to depict reactions, interactions, transport processes and binding events. This palette of entities consists of chemical compounds, proteins, nucleic acids, cellular membranes, subcellular structures, tissues, and organs. All of the visual elements in it can be interactively adjusted and customized. Furthermore, because this tool is a web server, all pathways and pathway elements are publicly accessible. This kind of pathway &#34;crowd sourcing&#34; means that PathWhiz already contains a large and rapidly growing collection of previously drawn pathways and pathway elements. Here we describe a protocol for the quick and easy creation of new pathways and the alteration of existing pathways. To further facilitate pathway editing and creation, the tool contains replication and propagation functions. The replication function allows existing pathways to be used as templates to create or edit new pathways. The propagation function allows one to take an existing pathway and automatically propagate it across different species. Pathways created with this tool can be &#34;re-styled&#34; into different formats (KEGG-like or text-book like), colored with different backgrounds, exported to BioPAX, SBGN-ML, SBML, or PWML data exchange formats, and downloaded as PNG or SVG images. The pathways can easily be incorporated into online databases, integrated into presentations, posters or publications, or used exclusively for online visualization and exploration. This protocol has been successfully applied to generate over 2,000 pathway diagrams, which are now found in many online databases including HMDB, DrugBank, SMPDB, and ECMDB.

PathWhiz is a comprehensive, online pathway drawing tool for generating biochemical and biological pathways. It uses publicly accessible databases and easily expandable palettes consisting of pre-drawn pathway components. This protocol describes how to easily build new pathways, replicate and edit existing pathways, and propagate previously drawn pathways to different organisms.

生成高品質の機械可読の生物学的経路のためのWebツール

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...