Nous avons développé une méthode simple, rapide et rentable d’extraction de l’ADN génomique de C.elegans qui fonctionne très bien pour les applications en classe et de recherche. Ces protocoles peuvent être utilisés de manière fiable pour produire rapidement des modèles d’ADN à partir d’un seul ou d’un petit échantillon de C.elegance pour les applications basées sur la PCR. Les utilisateurs qui n’ont pas d’expérience dans la cueillette de vers ou l’utilisation d’un micropipetter peuvent avoir du mal à suivre les étapes nécessitant ces compétences.
Regarder un pratiquant qualifié et pratiquer peut aider. Farhan Lakdawala, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour extraire l’ADN d’un seul ver Caenorhabditis elegans, définissez d’abord le programme de lyse consistant en un cycle à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 95 degrés Celsius pendant trois minutes dans un thermocycleur.
Pour préparer la solution de lyse, ajoutez d’abord 0,8 microlitre de solution d’extraction du kit à la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 millilitre sur glace. Ajoutez ensuite 0,2 microlitre de solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de solution d’extraction et mélangez par caresses. Avec la sélection d’un ver pour l’extraction de l’ADN, identifiez d’abord un animal L4 ou adulte sous un microscope à dissection.
Un hermaphrodite L4 peut être identifié par une vulve caractéristique qui est visible comme un demi-cercle pâle au milieu de l’animal. Pour identifier un hermaphrodite adulte, sélectionnez l’un des plus grands animaux de la plaque qui peut avoir des embryons ovales visibles dans son utérus. Ensuite, à l’aide d’un pic de fil en platine, transférez l’animal sélectionné dans la solution.
Pour recueillir le contenu au fond du tube, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante. Placez ensuite le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse défini précédemment. Une fois ce programme de lyse terminé, centrifugez brièvement le tube et mettez-le sur la glace.
Ajoutez ensuite 0,8 microlitre de solution de neutralisation du kit et mélangez par pipetage. Encore une fois, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante. Si le lysat n’est pas utilisé immédiatement, conservez le tube à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.
Pour extraire l’ADN d’un ver individuel aussi, d’abord, réglez le programme de lyse d’un cycle à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 95 degrés Celsius pendant trois minutes dans un thermocycleur. Ensuite, préparez la solution de lyse en ajoutant d’abord deux microlitres de la solution d’extraction du kit sur la paroi intérieure d’un tube PCR de 0,2 millilitre sur de la glace, suivi de l’ajout de 0,5 microlitre de la solution de préparation tissulaire du kit à la gouttelette de solution d’extraction, puis mélangez le contenu par pipetage. Après avoir identifié L4 ou des animaux adultes, utilisez un pic à fil de platine pour transférer un nombre suffisant d’animaux dans la solution.
Ensuite, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante, puis placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme de lyse précédemment défini. Une fois le programme terminé, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur de la glace. Ajoutez ensuite deux microlitres de la solution de neutralisation du kit au tube et mélangez par pipetage.
Encore une fois, centrifugez le tube pendant deux à trois secondes à 2000 x g à température ambiante. S’il n’est pas utilisé immédiatement, conservez le lysat à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. L’ADN génomique extrait par le protocole pourrait être utilisé avec succès comme modèle de PCR, à la fois le kit commercial et la méthode traditionnelle de protéinase K ont produit de l’ADN avec des niveaux similaires d’amplification PCR d’un produit de paire de base 2100 et d’un produit de paire de bases 500.
La méthode du kit pour la lyse de l’ADN a également fourni des modèles de PCR efficaces pour une variété d’enzymes d’ADN polymérase. Même à différentes dilutions, l’ADN extrait d’un seul animal par le kit commercial a pris en charge l’amplification par PCR d’un fragment d’ADN de 2100 paires de bases avec une efficacité équivalente. Cependant, l’amplification d’un fragment d’ADN de 500 paires de bases variait avec la concentration du gabarit.
La pertinence de l’ADN extrait d’un seul animal ou de plusieurs animaux comme modèle de PCR pour déterminer le génotype a également été démontrée par l’amplification réussie d’un gène et de sa variante mutée. Comme ce protocole implique le pipetage d’un petit volume de réactifs, pour assurer la cohérence, utilisez un mélange maître pour les réactions multiples, une bonne technique de tuyauterie et des pipettes bien calibrées. En outre, la rotation du contenu du tube assure une lyse appropriée.
Cette méthode pourrait être mise à l’échelle, adaptée pour extraire l’ADN génomique de C.elegans pour d’autres applications en aval, et pourrait être utilisée pour extraire l’ADN d’autres espèces de nématodes. Compte tenu de la simplicité, de la rapidité, de la robustesse et du faible coût du protocole, il est bien adapté aux applications de recherche et de classe où le temps et les ressources sont limités.
